柱凝膠技術(shù)在輸血前抗體篩檢中的應(yīng)用分析及方法學(xué)探討

[摘要] 目的 對6463例輸血、妊娠史的受血者進(jìn)行不規(guī)則抗體（IAb）篩查，并評估微柱凝膠技術(shù)（MGT）、聚凝胺技術(shù)（MPT）和抗人球蛋白試管法（CTT）在輸血前抗體篩檢中IAb陽性標(biāo)本的應(yīng)用價值。 方法 IAb抗D、抗E陽性者，用三種方法進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋效價比對，檢測其靈敏度。 結(jié)果 抗D抗體三種方法靈敏度檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；抗E抗體檢測MPT法與CTT法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 檢測中發(fā)現(xiàn)MGT的靈敏度最高，其靈敏度較MPT高2～4個滴度，較CTT法高出3～5個滴度，往往MPT法和CTT法對IAb較弱的標(biāo)本為陰性時，MGT法仍能檢出。MGT法操作簡便、省去洗滌步驟、重復(fù)性好，易于批量和標(biāo)準(zhǔn)化操作，適于在血型血清學(xué)的檢測中廣泛應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 柱凝膠技術(shù)；不規(guī)則抗體；聚凝胺技術(shù)；抗人球蛋白試驗

[中圖分類號] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）28-0111-03

抗體篩選是輸血前檢查的重要項目之一。通過抗體篩選可以避免含有弱抗體的受血者輸入含有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞而受到免疫刺激， 甚至發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)， 同時也為受血者尋找相合的血液提供理論依據(jù)。不規(guī)則抗體（IAb）是指ABO血型系統(tǒng)抗A、抗B以外的血型抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應(yīng)及疑難配型的主要原因，多為IgG抗體，患者反復(fù)多次輸血和妊娠可產(chǎn)生免疫性抗體導(dǎo)致遲發(fā)性輸血反應(yīng)，輸血前及時檢測患者血清中IAb，是安全輸血的重要保證，我院開展柱凝膠技術(shù)（MGT）對所有輸血、妊娠史的受血者進(jìn)行IAb篩查，并對IAb陽性標(biāo)本用微柱凝膠技術(shù)（MGT）、聚凝胺技術(shù)（MPT）、抗人球蛋白試管法（CTT）三種方法進(jìn)行對比分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

2007年11月～2011年10月本院手術(shù)備血和治療用血的受血者6 463例，其中男3 602例，女2 861例，年齡1～95歲。

1.2 儀器與試劑

微柱凝膠卡、專用孵育箱和離心機(jī)，均為長春博迅生物技術(shù)有限公司提供，Lab篩檢細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜細(xì)胞為上海血液生物有限公司產(chǎn)品；IgG抗-D血清由上海生物醫(yī)藥制品有限公司提供；抗人球蛋白血清抗IgGC3由上海市血液生物有限公司提供，MPT試劑盒（中山生科試劑儀器有限公司產(chǎn)品）；O 型試劑紅細(xì)胞的制備：取3 個不同O 型RhD 陽型獻(xiàn)血員的紅細(xì)胞混合，用0.9% 生理鹽水洗滌3 次。將洗滌好的紅細(xì)胞用0.9%生理鹽水配成濃度為0.8%紅細(xì)胞懸液備用。

1.3 方法

受血者抽取EDTA-k2抗凝血3 mL，標(biāo)本必須是輸血前3 d，分離血漿離心5 min。

1.3.1 微柱凝膠卡式法（MGT） 微柱卡編號，向標(biāo)記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的三個微柱反應(yīng)孔各加0.8%～1.0%篩檢細(xì)胞50 μL，再向?qū)?yīng)微柱管中加入受檢者血漿50 μL，每次均設(shè)陰陽性對照，置37℃孵育器15 min，專用離心機(jī)離心5 min，900 rpm 2 min，1 500 rpm 3 min，取出觀察結(jié)果，紅細(xì)胞相互凝集處于凝膠柱的上方為陽性，反之，篩檢細(xì)胞能通過分離柱，沉降到凝膠柱底部為陰性。用1～10號譜細(xì)胞采用微柱凝膠法，作抗體特異性鑒定。

1.3.2 聚凝胺法（MPT）檢測Lab 待測管加受血者血漿1滴，加3%～5%篩檢細(xì)胞懸液1滴，各管加低離子介質(zhì)（LIM）3滴，混勻，室溫放置30 s，加入polyberne試劑2滴，3 500 r/min離心15 s輕搖，肉眼可見明顯凝集，各管加假凝集稀釋液1滴，輕搖，非特異性凝集1 min后消失為陰性，反之為陽性。

1.3.3 試管法間接抗人球蛋白試驗（CTT） 2滴受血者血漿與1滴5%篩檢細(xì)胞混合后至37℃孵育1 h，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，將洗滌后的紅細(xì)胞加入抗人球蛋白試劑于3 000 rpm離心15 s，顯微鏡觀察，陽性對照和被檢管出現(xiàn)凝集，即為陽性，而陰性管不凝集。

1.3.4 比對MGT、CTT、MPT靈敏度，對不完全抗體陽性抗E和抗D受檢者血漿，用生理鹽水進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，1∶2至1∶1 024，稀釋后的血漿按抗體篩選方法做效價測定，反應(yīng)到達(dá)1+的最大稀釋倍數(shù)為該抗體的效價，稀釋后的紅細(xì)胞懸液用傳統(tǒng)抗球蛋白法進(jìn)行檢測.平行實驗重復(fù)5次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13. 0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用幾何平均值計算法，計算CTT法與MGT法測抗-D和抗E效價的平均值，CTT法與MGT、MPT法靈敏度檢測結(jié)果比較采用幾何均數(shù)法的t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種方法對28例抗D、抗E抗體陽性效價比較

MGT法測定IAb，將抗D、抗E陽性受血者標(biāo)本連續(xù)倍比稀釋為1∶2至1∶1 024進(jìn)行檢測，結(jié)果紅細(xì)胞懸浮在凝膠柱的上方和中間，由強(qiáng)到弱有肉眼可見的凝集顆粒，陽性的最高稀釋度效價為1∶1 024；MPT法測定的最高稀釋度為1∶64時肉眼可見明顯的凝集，1∶128顯微鏡下可見紅細(xì)胞呈弱凝集；CTT法測定，在最高稀釋度為1∶64時肉眼可見明顯的凝集，1∶128顯微鏡下未見凝集。見表1。對抗體陽性標(biāo)本采用血清半定量三種方法檢出率分別為MGT法100%，MPT法90%，CTT法72%，對抗D抗體三種方法靈敏度檢測，MPT法與CTT法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。

2.2 52例Lab陽性抗體分布

采用MGT法對6 463例受血者進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查，MPT法篩檢出IAb陽性52例，陽性率0.80%（52/6 463），其中男22例，女30例，男性均有輸血史，女性12例有輸血史，25例有妊娠史，其中7例既有妊娠史又有輸血史。用MGT法進(jìn)一步作特異性抗體分型，鑒定出特異性39例、抗D 18例、抗E 10例、抗C 2例、抗c 2例， 抗-Mia 1例、抗-Jka 2 例、抗-Lea 1例、自身抗體3例、未鑒定出特異性抗體13例。見表2。抗E效價抗體效價比對，MPT法與CTT法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），MGT法與CTT法比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），顯示CTT法和MPT法在IAb較弱時可造成漏檢。

表1 三種方法對28例抗D、抗E抗體陽性效價比較

3 討論

在6 463例受血者血清中檢出IAb 52例，陽性率0.80%（52/6 463），高于國內(nèi)文獻(xiàn)報道[1]。IAb的產(chǎn)生可導(dǎo)致輸血人群遲發(fā)性免疫溶血反應(yīng)，嚴(yán)重者可危及生命。被檢出的52例IAb陽性患者中，18例抗D患者，年齡35～73 歲，抗D 的產(chǎn)生主要是《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》實施前輸血的患者或是有多胎孕產(chǎn)史的患者。10例抗E 患者有8例為血液病和腫瘤病患者，均有2 年以上輸血史。臨床上抗E 引起的溶血反應(yīng)發(fā)生率約占Rh 血型系統(tǒng)溶血反應(yīng)30.7%。采用CTT法對52例陰性標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中抗-Lea抗體未檢出，CTT法需3 次洗滌紅細(xì)胞， 可能將紅細(xì)胞表面的Lea 抗原洗脫， 從而造成陰性反應(yīng)。據(jù)報道每輸1u紅細(xì)胞使受血者產(chǎn)生同種抗體的幾率為1%～1.6%，多次輸血產(chǎn)生同種抗體的幾率為15%～30%，Rh陰性患者輸入1u的Rh陽性紅細(xì)胞懸液，有80%患者在2～5個月內(nèi)產(chǎn)生抗D[2]。Rh抗原強(qiáng)弱的順序D>E>c>C>e。Rh血型系統(tǒng)是紅細(xì)胞血型中最復(fù)雜的血型系統(tǒng)，被視為臨床上產(chǎn)生溶血性輸血反應(yīng)的主要原因之一，抗D是引起輸血反應(yīng)最嚴(yán)重的一種，在輸血工作中，除ABO同型輸注外，Rh系統(tǒng)中考慮D抗原陰性患者輸血的同時，更應(yīng)加強(qiáng)E抗原相同配血，可大大降低IAb產(chǎn)生概率。

對28例抗D、抗E陽性標(biāo)本，用MGT 、CTT、MPT三種方法做抗體效價比對，結(jié)果顯示MGT的靈敏度最高。研究發(fā)現(xiàn)，MGT 法檢測抗D 的靈敏度為5 ng/mL， 而CTT法檢測的靈敏度為11 ng/mL。MGT法檢測抗D 的靈敏度高于CTT檢測[3]，與我們的研究結(jié)果一致。檢測中發(fā)現(xiàn)MGT的靈敏度最高，其靈敏度較MPT高2～4個滴度，較CTT法高出3～5個滴度，往往MPT法和CTT法對IAb較弱的標(biāo)本為陰性時，MGT法仍能檢出，可以檢測Rh 、MNSs、Duffy、kelL、Lewis、p 等血型系統(tǒng)的抗體，IAb多為IgG抗體，主要通過輸血和妊娠及不明原因的類抗原刺激產(chǎn)生免疫刺激產(chǎn)生，在鹽水介質(zhì)中不能凝集，而只能致敏相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞，經(jīng)典的間接抗球蛋白法操作繁瑣、敏感性低且費時，很難在臨床推廣[4]，通過實際操作發(fā)現(xiàn)，受血者采用MGT法進(jìn)行IAb篩查陰性者，交叉配血時無不和現(xiàn)象，提高了配血成功率。對IAb陽性標(biāo)本繼續(xù)作抗體鑒定，提前準(zhǔn)備相合的血液，避免和減少因免疫性輸血反應(yīng)的發(fā)生。

MGT是血型血清學(xué)方法的一項新的免疫學(xué)檢測技術(shù)，通過微柱凝膠的微孔過濾作用和抗原抗體特異性反應(yīng)作用，經(jīng)低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠上層，呈陽性，而游離的單個紅細(xì)胞，則穿過微孔到達(dá)凝膠底部，呈陰性反應(yīng)，由于凝膠中已經(jīng)含有抗IgGC3和各種血型抗體，從而簡化了實驗過程，應(yīng)用微柱凝膠法進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗可免去洗滌紅細(xì)胞步驟[4]，只需加入樣本即可。由于采用了混合細(xì)胞進(jìn)行檢測，涵蓋的抗原數(shù)目增多，可以盡可能多地檢出臨床有意義的抗體，為安全輸血提供了保障。MGT法對標(biāo)本要求高，標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞都應(yīng)保證新鮮，無細(xì)菌污染，標(biāo)本及時檢驗，制備的紅細(xì)胞懸液不能超過1%，加樣前樣本離心5 min，要充分除去纖維蛋白，為避免血漿蛋白的影響，保證結(jié)果的正確判讀，應(yīng)先加入篩選紅細(xì)胞，紅細(xì)胞濃度要適當(dāng)（0.5%）；要每次做陰陽性對照； 篩選陽性時要用試管法復(fù)查對照，肝素抗凝血可造成IAb假陽性，必須使用EDTA抗凝血標(biāo)本，否則易引起假凝集、不抗凝標(biāo)本，由于不能充分去除纖維蛋白使其在微柱凝膠中析出，阻礙了陰性紅細(xì)胞沉淀，也會呈假陽性反應(yīng)；MGT法在溫箱內(nèi)孵育15 min，可有效消除冷凝集素的影響，因此孵育時間要充分，并要控制室溫。

MGT法結(jié)果直觀可靠、無需顯微鏡觀察、重復(fù)性好、易于批量和標(biāo)準(zhǔn)化操作、標(biāo)本用量少、減少了操作污染，在醫(yī)院輸血科，尤其是標(biāo)本量大的大型綜合性醫(yī)院中有必要將MGT作為輸血前IAb常規(guī)檢測項目推廣使用。通過實踐應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，采用微柱凝膠技術(shù)篩檢受血者IAb可避免含有抗體的受血者輸入含有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞而受到免疫刺激，選擇相配合的血液輸注；對受血者采用MGT方法進(jìn)行常規(guī)抗體篩查陰性者，在交叉配血時無不和現(xiàn)象，大大提高了配血成功率，減少了免疫性溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] 陳靜，馬濤. 微柱凝膠技術(shù)篩選及鑒定不規(guī)則抗體的臨床應(yīng)用[J]. 河北醫(yī)藥，2008，8（30）：1233-1234.

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[4] 孔祥騫，吳松遠(yuǎn)，楊作云. 低離子聚凝胺技術(shù)在臨床輸血檢驗中的應(yīng)用價值探討[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（6）：983.

（收稿日期：2012-07-30）