健脾解毒方對裸鼠人腸癌血管新生的抑制作用

[摘要] 目的 研究中藥復(fù)方健脾解毒方對裸鼠人腸癌血管新生的抑制作用。 方法 建立人腸癌COLO-205細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為5組：模型組（生理鹽水組），健脾解毒方低、中、高劑量組[250、500、1000 mg/（kg·d）]和阿霉素組[1 mg/（kg·d）]。給藥第21天，各組均處死荷瘤鼠，測量腫瘤大小及質(zhì)量。免疫組化法檢測瘤體的MVD和COX-2表達(dá)；ELISA測定血清中VEGF的表達(dá)。 結(jié)果 健脾解毒方低、中、高劑量組的瘤重抑制率分別為33.33%、36.54%、44.04%。免疫組化結(jié)果顯示，模型組、健脾解毒方低、中、高劑量組瘤體MVD計(jì)數(shù)分別為63.67±3.21、50.33±4.51、47.00±3.00、34.67±4.51，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ELISA結(jié)果顯示，健脾解毒方低、中、高劑量組血清VEGF表達(dá)與模型組相比顯著下調(diào)（P<0.01）。健脾解毒方能夠下調(diào)瘤體中COX-2蛋白表達(dá)，并且呈一定劑量依賴效應(yīng)。 結(jié)論 健脾解毒方對人腸癌皮下移植瘤生長和血管新生具有一定抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)COX-2和VEGF表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 健脾解毒方；結(jié)腸癌；血管新生；環(huán)氧化酶-2

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）03-

大腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國乃至世界上呈逐年上升趨勢[1-2]。目前以手術(shù)治療為主，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，其主要原因是腫瘤血管新生導(dǎo)致腫瘤向其他臟器組織侵襲、轉(zhuǎn)移。健脾解毒方由生黃芪、黨參、白術(shù)、薏苡仁、豬苓、石見穿、野葡萄藤、八月札組成。實(shí)驗(yàn)研究表明，健脾解毒方能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗侵襲轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等作用[3-6]。為了進(jìn)一步探討健脾解毒方對大腸癌的治療作用，本研究通過建立裸鼠人腸癌皮下移植瘤模型，研究健脾解毒方對大腸癌的血管新生的抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

人腸癌COLO-205細(xì)胞系購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 動物

BALB/c裸小鼠，體質(zhì)量18～20 g，雄性，SPF級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2008-0016。

1.3 藥物

中藥復(fù)方健脾解毒方由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備[7]（批號：100702）；阿霉素購自Pfizer Italia S.r.l （批號：8NB002-A）；山羊抗小鼠CD34單克隆抗體（美國RD公司）；兔抗人COX-2單克隆抗體（美國CST公司）；VEGF ELISA試劑盒為上海博谷生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 儀器

CKX41/U-RFLT50熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；GalaxyS CO2培養(yǎng)箱（英國RS Biotech公司）；JY6001型天平（上海精科公司天平儀器廠）；5804R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 人腸癌細(xì)胞培養(yǎng)

人腸癌COLO-205細(xì)胞，用含10%的胎牛血清、1.5 g/L碳酸氫鈉、1.5 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤模型的建立及分組給藥

2.3 腫瘤體積、相對腫瘤體積、相對腫瘤增值率和腫瘤抑制率的計(jì)算

2.4 免疫組化Envision法檢測瘤體MVD的表達(dá)

組織塊用福爾馬林固定液固定，乙醇脫水至二甲苯透明，石蠟包埋，切片，抗原熱修復(fù)，封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色程度，自來水充分沖洗終止反應(yīng)；復(fù)染，脫水，透明，常規(guī)樹脂封片；每批染色均用已知的陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。按照Banerji S 等[11]的方法，即在低倍視野（×100）下掃描整個瘤體組織切片，選擇最密集的微血管標(biāo)記區(qū)，低倍視野下確定微血管密集區(qū)后，然后在高倍鏡下（×200）選取3個不重復(fù)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，求其平均數(shù)即作為該標(biāo)本的MVD值。統(tǒng)計(jì)微血管的標(biāo)準(zhǔn)：CD34陽性染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃或棕褐色，黏膜組織內(nèi)孤立的棕黃色或棕褐色內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均計(jì)數(shù)為一個血管，肌層較厚及管腔紅細(xì)胞數(shù)>8個的血管不被計(jì)數(shù)。

2.5 ELISA法檢測裸鼠血清中VEGF表達(dá)

將裸鼠進(jìn)行摘除眼球取血，離心得到血清后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測定血清中VEGF的表達(dá)情況。操作步驟按參照上海博谷生物科技有限公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。將檢測結(jié)果用ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線專用軟件做出VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各檢測孔中VEGF的濃度。

2.6 免疫組化染色方法檢測環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）蛋白的表達(dá)

采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化染色法檢測COX-2蛋白的表達(dá)。以已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。計(jì)數(shù)采用雙盲法。采用圖像分析儀，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為在細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為陽性標(biāo)志。每張切片于高倍鏡下（×200）任選10個視野，細(xì)胞數(shù)>1000個以上，隨機(jī)觀察10個高倍視野，陽性計(jì)數(shù)采用雙盲法，以陽性率作為觀察指標(biāo)。陽性表達(dá)率=表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 健脾解毒方對裸鼠人腸癌的生長抑制作用

3.3 健脾解毒方對裸鼠人腸癌VEGF表達(dá)的影響

健脾解毒方低、中、高劑量組均能下調(diào)裸鼠血清中VEGF表達(dá)水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），呈劑量依賴性。見表1。這表明，健脾解毒方能夠抑制裸鼠人腸癌VEGF表達(dá)。

3.4 健脾解毒方對裸鼠人腸癌COX-2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

天然藥、傳統(tǒng)中藥有許多藥的活性成分具有抗腫瘤活性，在現(xiàn)代腫瘤治療中的作用日益受到重視，吸引了許多科研工作者對傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)功能、抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究。抑制腫瘤血管新生已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)不少中藥或其有效成分是通過抑制血管新生發(fā)揮抗腫瘤作用的，如復(fù)方苦參注射液，丹參酮ⅡA，人參提取物人參皂苷Rg3等。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾解毒方對人腸癌皮下移植瘤生長具有一定抑制作用，呈劑量依賴性；同時，健脾解毒方能夠抑制腫瘤MVD形成和下調(diào)促血管生成因子VEGF表達(dá)。

COX-2是催化花生四烯酸（Arachidonic Acid）產(chǎn)生前列腺素（Prostaglandins，PGs）的關(guān)鍵限速酶之一，被稱為“誘導(dǎo)型（inducible）”環(huán)氧合酶。COX-2屬誘導(dǎo)型，被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”，在正常組織中無表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因素包括生長因子、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等作用時，COX-2的表達(dá)迅速上調(diào)，PGE2是COX-2催化花生四烯酸生成的主要產(chǎn)物[15]。現(xiàn)已證實(shí)COX-2的過度表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其主要通過合成致癌物質(zhì)、促進(jìn)腫瘤血管新生、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤粘附與轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。COX-2選擇性抑制劑在體內(nèi)及體外均能發(fā)揮很好的抗腫瘤作用。Tsujii M等[16]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染COX-2基因的CaCo-2結(jié)腸癌細(xì)胞株，在體外培養(yǎng)時產(chǎn)生的VEGF、Ang-2等血管生成因子量比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株增加4-8倍，而COX-2抑制劑可使其恢復(fù)基礎(chǔ)水平。前期研究發(fā)現(xiàn)，COX-2/PGE2通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)大腸癌血管新生[17]。本研究通過免疫組化檢測瘤體COX-2蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健脾解毒方能夠下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)，這與前期研究發(fā)現(xiàn)健脾解毒方能夠抑制腫瘤血管新生和下調(diào)COX-2表達(dá)結(jié)果相一致[18-19]，說明健脾解毒方可能通過下調(diào)COX-2和VEGF表達(dá)抑制大腸癌血管新生。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Zhou LH等[13]丹參酮ⅡA可能通過COX-2途徑抑制C26結(jié)腸癌移植瘤模型MVD形成和下調(diào)血清中VEGF表達(dá)的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，健脾解毒方能夠抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長和MVD形成，其機(jī)制可能是通過調(diào)控COX-2表達(dá)抑制VEGF而發(fā)揮作用，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-01-07）