超聲波法與酶解法聯合制備短刺小克銀漢霉原生質體及其活性評價

[摘要]目的 采用超聲波細胞儀破碎法與酶解法聯合制備短刺小克銀漢霉原生質體，提高原生質體的制備量。 方法 采用蝸牛酶將短刺小克銀漢霉細胞壁消化，采用超聲波細胞破碎儀機械破碎加速其原生質體的釋放，得到符合實驗要求的原生質體。 結果 通過正交實驗優化得到制備短刺小克銀漢霉原生質體的條件是：以0.6 mol/mL氯化鉀作為滲透壓穩定劑，以10 mg/mL蝸牛酶為酶解劑，選用菌齡為12 h的菌絲，在37℃下酶解2 h，最后使用超聲波細胞破碎儀破碎菌絲體15 min。短刺小克銀漢霉活性原生質體的釋放量是7.5×10 7個/mL，且其7 d內的存活率維持在90%以上。 結論 超聲波細胞儀破碎法和酶解法聯合使用可有效提高短刺小克銀漢霉原生質體的釋放率和活性。

[關鍵詞]短刺小克銀漢霉；原生質體；超聲波細胞儀破碎法；酶解法

[中圖分類號] TQ920.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）03-

小克銀漢霉（Cunninghamella）是一種絲狀真菌，其屬于接合菌門毛霉菌目，現已發現共有14個種，最主要特點在于其具有與人體肝臟類似的藥物主要代謝酶—細胞色素P450酶（Cytochrome P450），可以對藥物進行體外轉化產生與哺乳動物相似的或者不同的代謝產物，現已證明其可以代謝的藥物有91種之多[1]，因此，小克銀漢霉可以作為藥物研究中的模式代謝菌，用于體外生物轉化藥物直接產生活性產物，廣泛應用于藥理學、毒理學、工業生產等研究領域。但對毒性和難溶性藥物的轉化，卻存在著轉化率較低，轉化時間長，產物單一等系列問題，分析其中主要原因在于，它本身存在的細胞壁阻礙了藥物與酶的結合，大大降低了轉化速率[2]。因此，采用一定工藝酶促降解其細胞壁，利用其原生質體直接轉化藥物是一種比較理想的方法。現已有報道采用研磨法、普通超聲波法、酶解法制備原生質體，以酶解法為最好，得到的原生質體產率最高，活性較好[3]。Sedlaczek等[4]已成功運用蝸牛酶制得的原生質體將11-脫氧皮質醇轉化率提高了40倍。

雖然酶解法可以獲得較高產率的原生質體，但是裂解酶作用時間較長，長期使用也會對原生質體的活性產生影響，如果要得到產率高、產物豐富和活性更加好的原生質體則需要尋找更加有效的制備方法。而超聲波細胞破碎儀在植物有效成分的提取[4]、加速天然產物生物轉化[6-7]、組織蛋白提取[8]等方面的廣泛運用給我們提供了很好的思路。酶解法旨在通過特異性的酶降解反應將細胞壁消化，而超聲波細胞破碎儀則是利用超聲波的空化作用，使空泡周圍細胞的細胞壁擊穿破碎，從而進一步將原生質體釋放出來。我們推測兩者聯合使用，勢必會提高原生質體的制備率和活力。本文采用蝸牛酶解法與超聲波細胞儀破碎聯合的方法制備原生質體，將產率提高了14倍，且在7天內的存活率維持在90%以上，現報道如下：

材料與方法

材料

1.1.1 菌種 短刺小克銀漢霉AS 3.970購自中國食品發酵研究所工業微生物保藏管理中心（CICC，菌種編號：40267）

1.1.2 試劑和儀器 試劑：蝸牛酶（上海生工，SB0870），熒光素二乙酸酯（上海生工，ZWY0014144），氯化鉀（KCl）、硫酸鎂（MgSO4）、甘露醇、葡萄糖，實驗用水為超純水。

儀器：恒溫搖床（ZHWY-111B，上海智誠）；霉菌培養箱（MJP-150，上海精宏）；隔水式恒溫培養箱（GNP-9080，上海精宏）；倒置顯微鏡（Nikon Te2000-u，日本）；光學正置顯微鏡（Nikon E200，日本）；超聲波細胞破碎儀（MISONIX，寧波海曙科生超聲設備有限公司）；高速冷凍離心機（5430R，Eppendorf中國有限公司）。

1.1.3 培養基 固體斜面培養基：采用土豆葡萄糖瓊脂培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL）。液體培養基：采用土豆培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，自然pH）。

1.1.4 原生質體滲透壓穩定液 由無菌水配制0.6 mol/L的KCl、MgSO4、甘露醇、葡萄糖滲透壓穩定液。

1.1.5 酶液的配制 稱取1 g蝸牛酶溶解于0.6 mol/L的滲透壓穩定劑中，制得20 mg/mL的蝸牛酶母液，經0.22 μm濾膜過濾除菌置于4℃冰箱中儲存備用。使用時用相應的滲透壓穩定劑稀釋到所需濃度即可。

1.2 方法

1.2.2 原生質體的制備 稱取按1.2.1方法所制得的菌絲體1 g，加入1 mL的酶液，置于37℃恒溫培養箱酶解4小時后，加入20 mL滲透壓穩定劑，7500 r/min 離心20 min。取沉淀加入30 mL穩定劑重新懸浮，在冰水中使用超聲波細胞破碎儀進行破碎，時間為15min，振幅為10，每間隔1min運行30 s。破碎完成后，用300目過濾除去細胞壁碎片，再經4層擦鏡紙進一步純化，制得原生質體懸浮液。

1.2.3 原生質體的計數及活性檢測 原生質體活力的評估采用FDA染色法。量取100 μL FDA儲備液加入10 mL的滲透壓穩定劑稀釋成0.05%濃度的FDA染液。1 mL原生質體懸浮液加入200 μL的FDA染液，置于28℃恒溫箱染色10 min后在倒置熒光顯微鏡下用血球計數板進行原生質體的計數及活性檢測。

2 結果

2.2 優選制備原生質體的最佳滲透壓穩定劑

2.3 正交試驗優化確定原生質體制備最優條件

根據影響原生質體形成的四個關鍵因素：菌絲體的培養時間、蝸牛酶濃度、酶解時間及酶解溫度，根據表2進行L9（34）正交設計實驗，測定其對原生質體形成與活性的影響，結果見表3所示。由正交實驗結果分析表4的極差R值可得知，影響原生質體釋放因素的主次為B>C>A>D，通過P值分析可得最佳實驗組合為A2B3C3D3，即當菌齡為24 h，蝸牛酶的濃度為20 mg/mL，酶解時間為12 h，酶解溫度為37℃時，得到小克銀漢霉原生質體的數目最多。從原生質體死亡率的正交試驗結果分析（表5）可得到影響原生質體活性的影響因素主次為C>B>D>A，最佳實驗組合為A1B2C1D3。酶解時間是影響原生質體活性的主要原因，隨著酶解時間的延長，原生質體活性急劇下降，所以實驗中應盡量減少酶解時間。原生質體的活性是小克銀漢霉原生質體對底物進行生物轉化的重要影響因素，因此選用制備原生質體的最優條件為A1B2C1D3。

2.5 原生質體酶解過程形態

3 討論

超聲波細胞破碎儀是利用一種超聲波在液體中產生空化效應的多功能、多用途的儀器，它能用于各種動植物細胞、病毒細胞、細菌及組織的破碎。本文采用蝸牛酶酶解法和超聲波細胞破碎儀機械法聯合運用制備原生質體，這與Xiong等[9]用單酶解法報道相比要高出14倍，這是沒有報道過的。筆者推測其中的原因是雖然蝸牛酶在作用長達4 h后可得到大量小克銀漢霉原生質體，但是不可回避的問題是蝸牛酶在降解細胞壁時，對原生質體活性有嚴重的損害，同時大量的具有代謝和轉化藥物的酶也同時有可能被降解，這可能是造成藥物轉化率低的主要原因。本文聯合運用超聲波細胞破碎儀機械法將蝸牛酶解4 h縮短到2 h，提高了原生質體的活性，且原生質體在7 d內的存活率達90%以上。由此推測聯合使用蝸牛酶法和超聲波細胞破碎儀機械法可使原生質體的活性提高，這是一種很有效的制備原生質體的方法。

現在檢測原生質體活性方法主要是通過原生質體的再生率進行評估，這種方法需要將原生質體恢復成菌絲體，非常復雜耗時[10]。Rotman等[11]提出的FDA染色法是一種簡單快速檢測方法，FDA可以直接與活性原生質體的酯酶結合發出熒光后即可檢測，而不用菌絲體，節省了大量的檢測時間。雖然FDA廣泛運用于植物原生質體的活性檢測，但應用于微生物原生質體活性檢測仍鮮有報道。本研究運用FDA染色法準確快速檢測出具有活性的短刺小克銀漢霉原生質體數量，并可隨時監測其活性變化，為原生質體的活性評估提供了簡單高效的方法。

本研究聯合運用酶解法和超聲波細胞破碎儀機械法，制備了高活性的原生質體，實驗證明，此法高效、產率高、成本低。本研究為小克銀漢霉原生質體制備提供了一種有效的方法。而對于短刺小克銀漢霉原生質體的其他酶的活性測定及其對藥物轉化率的分析有待于我們課題組進一步深入探索研究。

[參考文獻]

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[3]Mao Y，Wang D，Huang ZB. Application of Microbial Protoplast Fusion Technology in Genetic Breeding[J].China Biotechnology，2010，30（1）：93-97.

[4]Sedlaczek L，Dtugonski J，Jaworski A. Transformation of steroids by fungal protoplasts[J]. Appl Microbiol Biotl，1984，18（9）：166-169.

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[10] Xue W，Zhao XM，Liu SH.Protoplast Preparation and Regeneration of Monilia fructigena[J].Microbiology China，2010，37（1）：71-77.

[11]Rotman B，Papermaster BW.Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.1966，55（1）：134-141.

（收稿日期：2012-12-24）