黃芪及黃芪多糖對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染小鼠腸黏膜局部免疫的調(diào)節(jié)作用

[摘要] 目的 探討黃芪及黃芪多糖對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染的免疫抑制小鼠的腸道局部粘膜免疫的調(diào)節(jié)作用。 方法 用醋酸地賽米松給Balb/c小鼠灌胃8 d，第9天接種1×106個(gè)隱孢子蟲(chóng)卵囊，建立免疫抑制小鼠隱孢子蟲(chóng)感染模型。再經(jīng)黃芪水煎劑及黃芪多糖灌胃治療10 d，并設(shè)正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和乙酰螺旋霉素對(duì)照組。每日計(jì)數(shù)小鼠糞便中隱孢子蟲(chóng)卵囊的數(shù)量，于實(shí)驗(yàn)第20天，光學(xué)顯微鏡觀察腸組織病理學(xué)改變，ELISA法測(cè)定腸組織勻漿上清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平及小腸黏液SIgA，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞下T細(xì)胞亞群。 結(jié)果 與模型組比較，黃芪水煎劑組、黃芪多糖組和乙酰螺旋霉素組小鼠卵囊排出數(shù)量減少，腸組織病理學(xué)改變較輕，免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量、小腸黏液SIgA及腸組織勻漿上清IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 黃芪水煎劑及黃芪多糖通過(guò)上調(diào)腸道黏膜局部免疫功能促進(jìn)隱孢子蟲(chóng)感染小鼠恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；黃芪多糖；隱孢子蟲(chóng)；黏膜免疫

[中圖分類號(hào)] R967 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）03-

隱孢子蟲(chóng)病是一種世界范圍內(nèi)的人畜共患病，流行遍布90多個(gè)國(guó)家，是世界最常見(jiàn)的6大腹瀉病因之一[1]。艾滋病患者隱孢子蟲(chóng)感染率可達(dá)48%，是其致死重要因素[2-4]。隱孢子蟲(chóng)感染和致病已經(jīng)成為人類健康和公共衛(wèi)生安全的重大威脅，同時(shí)也對(duì)畜牧經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重危害。隱孢子蟲(chóng)易致免疫功能低下或缺陷者嚴(yán)重感染，提示隱孢子蟲(chóng)致病與機(jī)體免疫力有重要關(guān)系。黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效，中醫(yī)用于治療氣虛乏力，食少便溏等。本項(xiàng)研究采用醋酸地塞米松致免疫低下的隱孢子蟲(chóng)感染的小鼠模型，探討黃芪水煎劑及黃芪多糖對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染的腸道局部免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.2 一般狀況觀察 稱量小鼠體重，觀察動(dòng)物的活動(dòng)、毛色、攝食等。

1.2.3 糞便中卵囊計(jì)數(shù) 按照文獻(xiàn)[8，9]敘述方法，每天收集小鼠糞便，以飽和糖水溶液懸浮隱孢子蟲(chóng)卵囊，孔雀綠染液染色計(jì)數(shù)每克糞便中卵囊個(gè)數(shù)。

1.2.4 組織學(xué)觀察 取小鼠幽門下十二指腸上段約1 cm的組織塊，置中性福爾馬林固定液中。修塊、石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢、記錄、顯微照像。

1.2.5 腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離和檢測(cè) 取從幽門至回盲部的小腸，用含有5%小牛血清D-Hank’s液沖洗并翻轉(zhuǎn)，置含有15 mL消化液的離心管中37℃孵育40 min，充分震蕩后，300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾、離心，70%和40%雙層percoll密度梯度離心后，收集70%與40%Percoll之間的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.2.6 小腸黏液SIgA測(cè)定 取靠近回盲部1.5 cm的長(zhǎng)段，用載玻片輕刮粘膜表面粘液至小試管中，加入PBS 0.5 mL ，離心后吸取上清，-20°C保存待測(cè)。sIgA的檢測(cè)采用ELISA法，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)

模型組小鼠接受地塞米松誘導(dǎo)后，出現(xiàn)體重下降、行動(dòng)遲緩、體毛疏松、攝食減少，偶有腹瀉。正常對(duì)照組小鼠體重稍有增加、活潑好動(dòng)，其他組小鼠變化不明顯。

2.2 糞便中卵囊排出規(guī)律

3 討論

隱孢子蟲(chóng)屬于機(jī)會(huì)致病性寄生蟲(chóng)，通常不引起免疫力正常的個(gè)體發(fā)生感染，只有當(dāng)人體免疫力降低時(shí)，如患艾滋病時(shí)，才具有異常的致病力，導(dǎo)致患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和體征，甚至危及生命。隱孢子蟲(chóng)卵囊經(jīng)口感染后主要寄生在小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，因而，腸黏膜局部免疫在隱孢子蟲(chóng)感染中意義重大。

目前用于治療隱孢子蟲(chóng)感染的化學(xué)藥物主要有葉酸鹽拮抗劑、磺胺硝苯、甲氧芐氨嘧啶，抗生素主要有氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類。但是都不能從根本上殺死蟲(chóng)體，并能引起副作用[10]。所以，探索中醫(yī)藥對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染的治療很有必要。黃芪是扶正固本的傳統(tǒng)中藥材，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的報(bào)道。本研究探討的是黃芪及黃芪多糖是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠腸道局部黏膜免疫而促進(jìn)隱孢子蟲(chóng)感染的恢復(fù)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，黃芪水煎劑組小鼠健康、活潑，病理觀察腸道黏膜恢復(fù)好，說(shuō)明黃芪確實(shí)能促進(jìn)隱孢子蟲(chóng)感染的免疫低下小鼠的恢復(fù)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃芪水煎劑組小鼠腸道SIgA水平、黏膜下CD4+細(xì)胞及腸組織勻漿上清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的水平與模型組相比較，均明顯升高（P<0.05），而黃芪多糖組小鼠與黃芪水煎劑組小鼠相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示黃芪多糖是黃芪水煎劑中促進(jìn)黏膜免疫的主要成分。

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（收稿日期：2012-12-06）