老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及Fas、FasL表達(dá)的臨床意義

[摘要] 目的 探討老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及Fas、FasL表達(dá)的臨床意義。 方法 采用免疫組化法檢測(cè)25例老年性白內(nèi)障患者（觀(guān)察組）和10例成人尸體解剖非白內(nèi)障眼球（對(duì)照組）的晶狀體前囊膜組織中Fas、FasL的表達(dá)，并應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)兩組LECs的凋亡情況。 結(jié)果 觀(guān)察組LECs中凋亡細(xì)胞百分率為（30.4±3.7）%，對(duì)照組LECs中凋亡細(xì)胞百分率為（0.27±0.12）%。兩組凋亡細(xì)胞百分率比較，觀(guān)察組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.59，P<0.01）。觀(guān)察組LECs中Fas、FasL蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為60.0%、68.0%，而對(duì)照組LECs中Fas、FasL蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為10.0%、20.0%，兩組Fas、FasL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，觀(guān)察組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.95，7.68，P<0.01）。25例老年性白內(nèi)障患者的LECs中Fas、FasL蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡數(shù)間均呈正相關(guān)（r=0.574，0.614，P<0.01）。 結(jié)論 老年性白內(nèi)障形成過(guò)程可能與LECs的凋亡及Fas、FasL的調(diào)控有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞凋亡；Fas；FasL；晶狀體上皮細(xì)胞；老年性白內(nèi)障

[中圖分類(lèi)號(hào)] R776.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）03-

白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其發(fā)生過(guò)程中最早發(fā)生的是晶狀體上皮的損害，且晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類(lèi)型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。凋亡導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞密度降低，影響了晶狀體纖維生長(zhǎng)及生長(zhǎng)質(zhì)量，上皮細(xì)胞缺損使其下的晶狀體纖維滲透壓平衡失去控制，使這部分晶狀體纖維的透明性和完整性受損。但晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及其凋亡相關(guān)基因在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。目前研究認(rèn)為凋亡的基本分子框架是由細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)受體及其相應(yīng)配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所構(gòu)成的復(fù)雜體系，其中促凋亡基因Fas與FasL的相互作用被認(rèn)為參與多種細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制[1-3]。本研究通過(guò)研究老年性白內(nèi)障患者及正常人LECs的凋亡情況及相關(guān)調(diào)控基因Fas、FasL的表達(dá)，進(jìn)一步探討細(xì)胞凋亡參與老年性白內(nèi)障發(fā)生的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)在控制細(xì)胞凋亡水平上對(duì)白內(nèi)障進(jìn)行預(yù)防及藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年9月～2012年2月筆者所在醫(yī)院眼科收治的老年性白內(nèi)障患者25例為觀(guān)察組，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年齡50～79歲，平均年齡（62.4±4.6）歲。所有患者均在常規(guī)白內(nèi)障顯微手術(shù)術(shù)中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，獲取其中央部的晶狀體前囊膜（直徑約5 mm）。另收集無(wú)白內(nèi)障發(fā)生的成年人尸體解剖眼球的晶狀體前囊膜標(biāo)本10例（標(biāo)本來(lái)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院）為對(duì)照組。兩組取材標(biāo)本均置入10%中性緩沖甲醛溶液中固定24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約3 μm。

1.2 主要試劑

EnVision試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)as、FasL山羊抗人多克隆抗體（工作濃度1︰50）均購(gòu)自美國(guó)PTG公司。TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL方法檢測(cè)LECs的凋亡 切片常規(guī)脫蠟、水化、3%H2O2滅活處理、蛋白酶K消化，PBS液洗滌3次后加入TUNEL反應(yīng)液（含TdT和Bio-21-dUTP），置37℃水浴箱1 h；終止后加入SA-AP反應(yīng)液，置37℃水浴箱30 min；用DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀(guān)察。用無(wú)DNA末端轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液設(shè)為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，而正常細(xì)胞核被染為藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率：凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞的比值即為上皮細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化EnVision法檢測(cè)兩組LECs中Fas、FasL的表達(dá)。操作程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PBS代替一抗為陰性對(duì)照，試劑盒提供的樣本片為陽(yáng)性對(duì)照。染色結(jié)果判斷：LECs內(nèi)見(jiàn)黃色或棕色顆粒為染色陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇檢查5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。0%～5%為（-）；6%～25%為（+）；26%～50%為（++），>50%為（+++）。（+）～（+++）記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)之間的關(guān)系采用Spearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組LECs的凋亡情況比較

2.2 兩組LECs中Fas、FasL蛋白的表達(dá)比較

2.3 Fas、FasL表達(dá)與細(xì)胞凋亡數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

Fas又稱(chēng)為Apo-1或CD95，是屬于腫瘤壞死因子受體/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（TNFR/NG-FR）家族的I型跨膜糖蛋白；FasL是Fas在體內(nèi)的天然配體，屬于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白。Fas與FasL以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳類(lèi)機(jī)體細(xì)胞株表面，兩者在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的具有獨(dú)特作用：Fas起抑制作用，F(xiàn)asL則起促進(jìn)作用，二者結(jié)合后，可以誘導(dǎo)Fas陽(yáng)性細(xì)胞凋亡，這是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。目前多數(shù)學(xué)者均認(rèn)同F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制在機(jī)體與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗中具有重要的生物學(xué)意義，而對(duì)Fas/FasL在白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制研究仍處于初步階段。國(guó)外Okamura N等[6]比較了年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障LEC的免疫組化及RT-PCR表明有增殖性視網(wǎng)膜病變的白內(nèi)障組Fas及其mRNA的表達(dá)明顯增高。認(rèn)為細(xì)胞凋亡在合并有增殖性視網(wǎng)膜病變的白內(nèi)障組可能是通過(guò)Fas途徑介導(dǎo)的。國(guó)內(nèi)尹莉莉等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)Fas蛋白介導(dǎo)的LECs的凋亡在年齡相關(guān)性白內(nèi)障及糖尿病性白內(nèi)障的形成中起重要的作用。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法比較了對(duì)照組與老年性白內(nèi)障組LECs中Fas、FasL的表達(dá)情況，證實(shí)老年性白內(nèi)障患者LECs中Fas、FasL的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常人，且Fas、FasL在LECs中的表達(dá)與LECs凋亡百分率呈正相關(guān)（r=0.574，614，P<0.01）。提示老年性白內(nèi)障形成過(guò)程可能與Fas、FasL的調(diào)控有關(guān)。推測(cè)這可能是正常人LECs中盡管也存在Fas與FasL的聯(lián)合表達(dá)，但并不能夠引發(fā)自身凋亡，LECs的凋亡可能需要足夠數(shù)量的FasL-Fas結(jié)合來(lái)提供凋亡刺激信號(hào)。LECs一旦受到其他損害刺激時(shí)，可激活FasL-Fas系統(tǒng)，大量FasL-Fas表達(dá)并結(jié)合，從而提供凋亡的刺激信號(hào)，最后導(dǎo)致LECs發(fā)生自身凋亡，伴隨出現(xiàn)的水電平衡失調(diào)及其他一些病理改變，最終形成白內(nèi)障。相信隨著LECs凋亡及Fas、FasL表達(dá)調(diào)控機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，抑制Fas、FasL表達(dá)的相關(guān)分子生物學(xué)藥劑的研發(fā)，將為白內(nèi)障的非手術(shù)治療以及藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

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[7] 尹莉莉，管懷進(jìn)，胡紅莉，等.白內(nèi)障手術(shù)摘出前囊下晶狀體上皮細(xì)胞中整聯(lián)蛋白、Fas蛋白的表達(dá)[J].眼外傷職業(yè)眼病雜志，2008，30（12）：918-920.

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（收稿日期：2012-11-26）

[基金項(xiàng)目] 廣東省東莞市醫(yī)療衛(wèi)生一般科技項(xiàng)目（201210515011085）。