固相萃取—高效液相色譜法測定肉制品中玫瑰桃紅R

錢凱，車文軍，盧劍，武中平，王燕芹

摘 要：建立固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）測定肉制品中玫瑰桃紅R含量的分析方法。試樣經(jīng)乙腈水溶液超聲提取，Oasis WAX柱凈化后，以乙腈-乙酸銨緩沖溶液為流動相，經(jīng)C18柱分離后進行HPLC檢測。玫瑰桃紅R在0.5～10.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)大于0.999。1.0、2.0、10.0mg/kg 3個加標水平的平均回收率為90.6%～105.2%，相對標準偏差（RSD，n=6）為1.79%～4.25%，檢出限為0.26mg/kg。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確。

關鍵詞：高效液相色譜；固相萃取；肉制品；玫瑰桃紅R；測定

Determination of Bordeaux R in Meat Products by SPE-HPLC

QIAN Kai1，CHE Wen-jun1，*，LU Jian1，WU Zhong-ping1，WANG Yan-qin2

（1. Jiangsu Product Quality Testing and Inspection Institute， Nanjing 210007， China；

2. College of Science， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract：A solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography （SPE-HPLC） method was developed for the determination of bordeaux R in meat products. Samples were extracted with aqueous acetonitrile solution under ultrasonication， and cleaned up by Oasis WAX solid phase extraction. The separation of bordeaux R was carried out on a C18 column using acetonitrile-ammonium acetate buffer as mobile phase. The prepared calibration curve was linear between 0.5 and 10.0 mg/L with correlation coefficient more than 0.999. The mean recoveries at spiked levels of 1.0， 2.0 and 10.0 mg/kg were in the range of 90.6% to 105.2% with RSDsof 1.79% to 4.25% （n = 6）. The limit of detection was 0.26 mg/kg. The SPE-HPLC method was sensitive， reproducible and accurate.

Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）；solid phase extraction （SPE）；meat products；bordeaux R；determination

中圖分類號：O657.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）01-0035-03

近年來，在肉制品中違法添加工業(yè)合成染料的事件頻繁發(fā)生。如在鹵制雞腿、雞翅的生產(chǎn)過程中添加酸性橙；在臘腸的制作中加入羅丹明B；在冷凍蝦仁中檢出酸性紅等。這些工業(yè)染料可誘發(fā)人體癌變或引起人體皮膚、黏膜或呼吸道過敏，對人體健康危害極大。

鑒于工業(yè)染料對人體健康的危害性，目前食品中工業(yè)染料的檢測技術研究較受關注。國內(nèi)外均有文獻報道采用液相色譜[1-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[7-16]等方法對食品中多種工業(yè)染料進行分析，但對于食品包括肉制品中玫瑰桃紅R的測定還未見報道。本研究采用固相萃取凈化技術，建立高效液相色譜法二極管陣列檢測器測定肉制品中玫瑰桃紅R含量的方法，該方法高效、靈敏、快捷，能夠滿足我國肉制品的市場監(jiān)督與企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

王中王火腿腸 河南雙匯集團；精制豬肉脯 靖江雙魚食品有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 美國Fisher公司；氨水、甲酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Oasis WAX SPE柱（60mg/3mL）和Oasis HLB SPE柱（60mg/3mL） 美國Waters公司；玫瑰桃紅R 德國Dr. Ehrenstofer GmbH公司；玫瑰桃紅R用75%乙腈水溶液配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標準儲備液；提取液為75%乙腈水溶液，淋洗液為2%氨水溶液，洗脫液為1%鹽酸-甲醇溶液。

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；固相萃取裝置 美國Varian公司；超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；氮吹儀 美國Organomation Associates公司；超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；渦旋振蕩儀 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取試樣1.0g（準確至0.1mg）于50mL離心管中，加入5mL提取液，渦旋混合1min后，超聲提取20min，以8000r/min冷凍離心5min，收集上清液于試管中。殘渣再用5mL提取液重復提取一次，合并兩次上清液；將上清液過Oasis WAX固相萃取柱（先依次用3mL甲醇、3mL水活化）后，用5mL淋洗液淋洗小柱，減壓抽干，用5mL洗脫液洗脫，整個萃取過程控制流速約為1mL/min；收集洗脫液，氮氣吹至近干，用流動相溶解并定容至2.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后供HPLC分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A為水（含10mmol/L乙酸銨，pH3.0），B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：520nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑選擇的合適與否會直接影響方法的回收率。玫瑰桃紅R在水中有較好的溶解性，在甲醇、乙腈等極性溶劑中也有一定的溶解性。根據(jù)肉制品的基質(zhì)特點，本實驗分別選用甲醇、乙腈、乙腈-水溶液作為提取溶劑進行比較，實驗結果表明，甲醇和乙腈的提取效率沒有明顯差別；而考察不同比例的乙腈水溶液的提取效率時發(fā)現(xiàn)，乙腈體積分數(shù)在75%時提取效率最高，因此，最終選用75%乙腈水溶液作為提取溶劑。

2.2 SPE凈化過程的優(yōu)化

考慮到用75%乙腈水溶液對樣品進行提取時，會將一些干擾物質(zhì)提取出來，如油脂、食品添加劑等。如果對提取液過濾后直接進樣，一方面，在分析過程中會存在較大的干擾；另外，方法檢出限也達不到分析要求。而玫瑰桃紅R的分子結構中含有多個苯環(huán)，可以使用反相機理的固相萃取柱進行凈化；同時，玫瑰桃紅R屬于酸性染料，分子結構中帶有磺酸基團，因此在酸性條件下可以使用陰離子交換萃取柱進行凈化。本實驗比較了Oasis HLB和Oasis WAX兩種固相萃取柱的凈化效果。結果顯示，采用HLB固相萃取柱時，在萃取過程中容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，導致回收率較低，僅為15.2%～27.3%；采用WAX固相萃取柱時，發(fā)現(xiàn)萃取過程相對容易，凈化、富集效果理想，平均回收率為90.6%～105.2%，符合分析要求。

2.3 HPLC條件的優(yōu)化

2.3.1 檢測波長的選擇

將玫瑰桃紅R的標準溶液在波長200～700nm的范圍內(nèi)進行紫外-可見光譜掃描，得到其吸收光譜圖。實驗結果顯示，玫瑰桃紅R在波長520nm處有較大吸收。綜合考慮組分的響應值及干擾情況，最終確定定量檢測波長為520nm。

2.3.2 流動相的選擇

玫瑰桃紅R屬于較強極性離子化合物，在反相色譜中，流動相的pH值對其保留時間、峰形有影響。根據(jù)相關文獻[2-6]報道，選擇了乙腈-乙酸銨水溶液、乙腈-水（0.1%～0.5%甲酸）體系為流動相進行實驗，比較了不同體積比、不同乙酸銨濃度、不同pH值條件下對玫瑰桃紅R的保留時間、響應值和峰形的影響。實驗結果表明，在乙腈-10mmol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調(diào)pH值為3.0）的流動相體系中，采用梯度洗脫能在較短時間實現(xiàn)目標物的有效分離，峰形對稱，靈敏度高，結果見圖1。

圖 1 1.0mg/L玫瑰桃紅R標準溶液的色譜圖

Fig.1 Chromatogram of 1.0 mg/L bordeaux R standard solution

2.4 標準曲線與方法檢出限

準確移取0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mL上述100mg/L儲備溶液分別置于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的標準系列工作溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積對質(zhì)量濃度作線性回歸方程，以3倍信噪比計算檢出限。結果表明，玫瑰桃紅R在0.5～10.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，方法檢出限為0.26mg/kg，具有較高的靈敏度。組分的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)以及檢出限見表2。

注：Y.峰面積；X.標準溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）。

2.5 方法的回收率與精密度

在空白樣品中添加1.0、2.0、10.0mg/kg 3個水平的標準品進行回收實驗，按上述色譜條件和前處理方法進行測定，每個樣品重復處理6次，平均回收率及RSD見表2。結果顯示，3個加標水平的平均回收率為90.6%～105.2%，RSD為1.79%～4.25%，方法具有較好的回收率與精密度，滿足肉制品中玫瑰桃紅R含量檢測的要求。圖2為空白樣品及加標的色譜圖。

圖 2 空白樣品（A）與空白樣品加標（B）的色譜圖

Fig.2 Chromatograms of blank sample（A） and blank sample spiked with bordeaux R（B）

2.6 方法的實際應用

應用所建立的檢測方法，對肉脯、香腸等20多個肉制品樣品進行測定，以保留時間和紫外-可見吸收光譜進行定性，均未檢出含有玫瑰桃紅R殘留。

3 結 論

本研究建立了測定肉制品中玫瑰桃紅R含量的SPE-HPLC分析方法，通過對提取溶劑、凈化方式、檢測波長和流動相等參數(shù)的研究，確定了最佳實驗條件。結果表明，采用SPE方式凈化試樣，可有效地減少基質(zhì)的干擾、提高方法的靈敏度；同時考察了方法的回收率、精密度和檢出限，各項技術指標均符合分析要求，可為管理部門加強肉制品監(jiān)管提供技術支持。

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