H1N1豬流感病毒HA基因在畢赤酵母中的表達

袁芳艷 劉澤文 周丹娜等

摘要：利用 RT-PCR擴增H1N1亞型豬流感病毒HA基因，亞克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構建分泌型重組表達載體pPIC9K-HA。將線性化的pPIC9K-HA電轉化畢赤酵母菌GS115。將經MD平板篩選和PCR鑒定的陽性菌株用G418篩選多拷貝重組子。最后用1%甲醇誘導表達重組子，經SDS-PAGE和Western-blot檢測， H1N1亞型豬流感病毒HA基因在畢赤酵母中成功得到了表達，產物約60.4KD，并具有免疫活性。本研究為進一步研究豬H1N1亞型豬流感病毒HA基因的功能及檢測方法奠定了基礎。

關鍵詞：高職；養禽與禽病防治；實踐教學

中圖分類號：S858.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）09-0005-03

豬流感（Swine influenza，SI）是由A型流感病毒所引起的豬的一種急性、高度傳染性呼吸道疾病。臨床特點為急性發熱，傳播迅速，發病率高，死亡率低，易引起繼發感染，是危害養豬業的重要疾病之一。 隨著集約化養豬規模的不斷擴大，SI對養豬業構成了較大的威脅。自從1918年美國首次報道SI的暴發，1930年Shope從豬體中分離到HINl亞型SIV，迄今為止，SI已遍布亞、美、歐等地[1]。豬作為流感病毒的"混合器"，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過程中起著重要作用。2009年全球許多國家暴發了H1N1亞型流感，導致萬余人死亡。SI嚴重威脅著人類健康，并直接關系到公共衛生及人類的生命安全。

血凝素（HA）的裂解活性為病毒具有感染性和病毒在宿主體內的傳播所必需。HA基因在流感病毒識別靶細胞表面受體及穿膜過程中起重要作用，刺激機體產生的中和抗體可以抵抗病毒感染，還可以刺激機體產生細胞毒性淋巴細胞（CTL）反應[2]。因此，對HA基因編碼的蛋白的研究具有重要意義。本試驗克隆并在酵母表達了國內分離H1亞型豬流感病毒HA，為研究HA蛋白功能及建立SI診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌（毒）株

大腸桿菌DH5α由本室保存；酵母-大腸桿菌穿梭質粒pPIC9K載體、畢赤酵母菌株GS115/His-4均購自Invitrogen公司；H1N1亞型豬流感病毒為本實驗室分離保存。

1.2 試劑

大腸桿菌DH5α、酵母菌GS115感受態細胞、T4 DNA連接試劑盒購自愛思進生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、M-MLV逆轉錄酶試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Qiagen生物有限公司； DNA marker、蛋白質marker、限制性內切酶購自大連寶生物公司；酵母氮源YNB、G418購自北京普博欣公司；HRP標記的兔抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。試驗中用到的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

P1（擴增HA成熟肽基因上游引物）：ATCTACGTAGACACACTATGT（SnaBI）

P2（擴增HA成熟肽基因下游引物）：ATCGCGGCCGCATCATAAGTTCC（NotI）

α-factor：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

1.3 培養基

大腸桿菌LB培養基、酵母生長培養基YPD、選擇培養基MD以及酵母誘導表達培養基BMGY/BMMY均按美國Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達試劑盒的操作手冊配制。

1.4 H1N1亞型豬流感病毒RNA的提取及反轉錄

H1N1亞型豬流感病毒RNA的提取及反轉錄試驗分別按照按Qiagen RNAeasyTM 公司的RNA 提取試劑盒說明書及反轉錄試劑盒說明書進行。1.5 H1N1亞型豬流感病毒HA基因的擴增

以反轉錄合成的 cDNA 為模板，利用高保真度的Kod-plus DNA聚合酶和引物P1/ P2擴增HA基因片段，反應條件為94 ℃ 5 min；35個循環（94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。取 5.0 μl PCR 產物，用 0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，將PCR回收產物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.6 克隆載體pMD18T-HA的構建

合成H1N1中截去N端信號肽序列的成熟肽基因（HA），用T4 DNA連接試劑盒將合成產物和克隆載體pMD18-T于16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布卡納抗性平板，37 ℃培養至單菌落出現。小提質粒用SnaBI/ Not I雙酶切鑒定，酶切正確的質粒命名為pMD18T-HA，送上海生物工程有限公司測序。

1.7 穿梭質粒pPIC9K-HA的構建

用SnaBI/ Not I分別對HA和pPIC9K載體質粒進行雙酶切、用DNA凝膠回收試劑盒回收，連接，轉化DH5α，小提質粒，經酶切和測序鑒定，陽性重組質粒命名為pPIC9K-HA。取pPIC9K-HA質粒，經SalⅠ單酶切、電泳回收，得到線性化的pPIC9K-HA，置于-20℃備用。

1.8 酵母細胞的電轉化及重組酵母菌株的篩選

參照Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達操作手冊進行。為提高轉化效率，所制備的感受態細胞立即使用。

分別將10 μg線性化的pPIC9K-HA和pPIC9K質粒，與80 μL畢赤酵母感受態細胞混勻后，注入預冷的電轉杯中，冰浴5 min，進行電轉化（電轉參數為1500 V/25 μF/200 Ω）后，立即加入1 mL預冷的山梨醇混勻。取200～400 μL菌液涂布于營養缺陷型MD平板，28～30 ℃倒置培養2～4 d。能在MD平板上生長的菌落為His+轉化子。以α-factor/3'AOX1為引物，通過菌落PCR法確認重組菌株，將PCR陽性轉化子，經影印法依次接種到含G418濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的YPD培養基中，篩選多拷貝重組菌株。并在MD和MM培養基上篩選表型。

1.9 重組酵母菌株的誘導表達及表達產物的檢測

從含G418的YPD平板上挑取高抗性酵母菌株的單菌落于5 mL BMGY培養基中，28 ℃搖床培養24 h，離心收獲細胞。將沉淀物用10mL BMMY培養基懸浮，繼續28 ℃搖床培養4 d，每24 h向培養基中補加甲醇至終濃度為1%，從而保證酵母菌株的持續誘導表達。將甲醇誘導4 d的酵母菌液，離心收集上清，進行SDS-PAGE分析及Western-blot分析。Western-blot所用的一抗為鼠抗HA血清，二抗為HRP標記的兔抗鼠IgG。

2 結果

2.1 H1N1亞型豬流感病毒HA成熟肽基因的RT-PCR擴增

截去N端信號肽序列的H1N1亞型豬流感病毒成熟肽HA基因，擴增所得片段大小約1647 bp，與預期大小相符，見圖1 。

2.2 重組質粒的構建與鑒定

將鑒定正確（圖2）的重組質粒pMD18T-HA用SnaB I/ Not I進行酶切，鑒定正確后回收HA片段并插入相應酶切的pPIC9K中，構建重組質粒pPIC9K-HA，并用SnaB I/ Not I進行雙酶切鑒定。由圖3可知，酶切結果與預期結果9.3kb和1647bp相符。測序結果也顯示，重組穿梭質粒pPIC9K-HA構建正確。

2.3 重組酵母菌株的鑒定

對在MD平板上生長的菌落，以P1/P2及α-factor/3'AOX1為引物，通過菌落PCR法初步鑒定重組菌株，用P1/P2擴增出約1647bp的條帶，用引物α-factor/3'AOX1得到約1842bp（1647+195）的特意性條帶，表明轉化子基因組中確實整合有HA基因（圖4）。

PCR陽性轉化子，經G418抗性篩選，結果得到能在2.0 mg/mL G418濃度的YPD中生長的高抗性菌株。且在MD和MM培養基上進行表型篩選，挑取MD和MM培養基上均能正常生長的菌落，即基因型為His+Mut+的菌株。

2.4 表達產物的檢測

挑取pPIC9K-HA/GS115酵母菌株和pPIC9K/GS115酵母對照菌株，用1%的甲醇連續誘導4 d后，取培養基上清進行SDS-PAGE及Western-blot分析。結果表明（圖5），HA基因在畢赤酵母中成功獲得了分泌表達，并且表達產物具有免疫活性。

3 討論

血凝素（HA）是一種重要糖蛋白，是流感病毒主要的表面抗原，主要有3個功能：①在感染之前與宿主細胞表面病毒特異性受體結合；②介導病毒囊膜與核內膜的融合；③刺激機體產生中和抗體，產生免疫保護作用[3]。

大腸桿菌表達系統是基因工程中最常用的工具。具有遺傳背景清楚、使用安全、操作簡單、周期短、經濟等特點，使用較廣泛。但是它缺少真核細胞的細胞器，沒有真核表達體系的蛋白翻譯后加工過程，不能進行糖基化修飾，表達蛋白常常易于形成包涵體，常無其天然生物活性，需要進行復性處理。

酵母作為另一類異源蛋白表達系統有其獨到之處。一方面，它屬于單細胞生物，因而保留了細菌系統易于操作和生長快速的特點；另一方面，酵母又具有真核生物細胞的亞細胞結構，故具有翻譯后正確的加工和修飾功能[4]。畢赤酵母的醇氧化酶1基因的啟動子具有強誘導性和強啟動性，適于外源基因的高水平誘導表達[5]。而且畢赤酵母分泌的內源性蛋白少，培養基中雜蛋白含量低，表達產物既可以在胞內積累也可以直接分泌于培養基中，不需要經過細菌破碎以及復性過程，易于純化。酵母表達系統適用范圍很廣，具有不含特異性的病毒，不存在內毒素殘留，背景少等特點，隨著酵母表達載體、宿主菌株和發酵工藝的不斷改進，酵母表達系統已成為臨床和工業上大規模生產外源蛋白的最佳選擇[6]，也是高活性基因工程生物制品研制的重要技術。

酵母表達系統的表達受許多因素的影響，比如：外源基因A+T的組成及密碼子的偏愛性，A+T含量過高會導致轉錄提前終止；整合的拷貝數，一般而言，基因多拷貝轉化子的表達量要高于單拷貝轉化子[7]。本研究利用畢赤酵母pPIC9K載體帶有Kan抗性基因，在含高濃度G418（4.0mg/mL）的抗性平板篩選出高拷貝整合的轉化子，成功地分泌表達了H1N1亞型豬流感HA蛋白，為HA蛋白功能研究及SI診斷方法的建立打下基礎。

參考文獻：

[1] 余 華. 豬流感病毒分子生物學研究進展[J]. 動物醫學進展，

2010， 31（S）：208-212.

[2] 謝金文，苗立中，沈志強. 豬流感病毒蛋白研究進展[J]。中國畜牧獸醫， 2009，36（11）：157-161.

[3] 趙孟孟，潘俊斌，王 衡. 豬流感病毒血凝素基因的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫， 2010， 37（11）：69-72.

[4] 姚清俠. 豬α干擾素、豬β干擾素與豬γ干擾素的抗病毒活性及其免疫佐劑的研究[D].武漢：華中農業大學， 2007.

[5] CEREGHINO J L， CREGG J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiol Rev， 2000， 24（1）： 45-66.

[6] CREGG J M， CEREGHINO J L， SHI J， et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]. Mol Biotechnol， 2000， 16（1）： 23-52.

[7] 王黎明，王 琦，梅汝鴻.巴斯德畢赤酵母表達系統研究進展[J].微生物學雜志，2004，24（2）：42-45.