臍血間充質干細胞的分離培養鑒定及誘導分化研究

潘麗杰　陳妍　袁杰

[摘要]目的：分離培養人臍血間充質干細胞（ human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， hUCB-MSC），體外觀察其生長特性，并在特定條件下誘導分化，探討其成脂成骨分化能力。方法：采用沉降法和密度梯度離心結合貼壁培養法自臍血中分離間充質干細胞，倒置顯微鏡下觀察其形態及生長情況；流式細胞儀分析細胞周期并檢測細胞表面標志物；用茜素紅染色和油紅O染色分別鑒定其成骨成脂分化能力。結果：純化的hUCB-MSC貼壁生長，呈均一梭形，具有較強的增值能力，流式細胞儀分析P3代hUCB-MSC穩定表達間充質干細胞表面抗原標志 CD73，CD105 和 CD90 等，不表達造血標志 CD34 和 CD45；成骨誘導后3周后細胞茜素紅染色陽性；成脂誘導3周后細胞油紅O染色陽性。結論：本實驗分離的hUCB-MSC具有較強的增殖能力，表達間充質干細胞的表面標記， 具有成骨成脂分化潛能。

[關鍵詞]臍血；間充質干細胞；分化；鑒定

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）07-0735-04

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），作為一種成體干細胞用于再生醫學修復各種間葉組織如骨、軟骨、肌肉等，具有廣闊的發展空間[1-2]，目前應用較為廣泛為骨髓間充質干細胞，但由于骨髓取材屬有創操作且干細胞隨供體年齡增大有老化傾向等問題，在一定程度上限制其臨床應用[3]。與骨髓間充質干細胞相比，臍血干細胞來源廣泛，采集方便，不會對供者造成任何傷害，且有研究顯示患者接受異體移植后，臍血來源的MSCs顯示出更低的免疫原性反應[4-5]所以人臍血MSCs引起越來越多研究者的廣泛興趣。但是關于間充質干細胞的含量及能否成功體外培養存在很大爭議。因此，本實驗即探討hUCB-MSCs的分離培養及其生物學特性，以期建立穩定的體外分離培養體系；同時對其體外誘導分化能力也進行深入研究，以期為下一步研究奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料：所有標本均取自哈爾濱醫科大學附屬第一臨床醫學院婦產科順產及剖宮產的胎兒，孕婦體健，乙肝五項、梅毒等檢測均為陰性，胎兒無先天性疾病，取血前征得產婦及家屬同意并簽署知情同意書。0.25%胰蛋白酶/EDTA、DMEM/F12（美國， Hyclone），胎牛血清FBS（美國，Gibco），人淋巴細胞分離液（1.077 g/ml，天津TBD公司），地塞米松、維生素C、吲哚美辛、β-甘油磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和胰島素均購自美國Sigma公司。熒光標記小鼠抗人單克隆抗體：CD45-PE、CD34-APC、CD90-FITC、 CD105-FITC和CD73-PE均購自美國biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 hUCB-MSC的分離與培養[6]：經新生兒父母同意，采集新生兒臍血12份，每份50～80 ml，將所采集樣本于4h內處理。將抗凝臍血用同體積的PBS稀釋一倍，混勻，再與37℃預溫的3%明膠等比混合，室溫下靜置至血漿與紅細胞界面形成后，吸取血漿層，2000 r/min離心5 min，收集細胞；用5 ml DMEM/F12重懸所得細胞，按2：1的體積比加到人淋巴細胞分離液（1.077g/ml）表面，2000 r/min離心20 min，離心后吸取懸于分離液面的白膜層，獲得單個核細胞。PBS洗兩次，用DMEM/F12培養基（含體積分數為10%胎牛血清、10μg/L堿性成纖維細胞生長因子bFGF、100U/mL青霉素和100 g/L的鏈霉素）懸浮上述細胞，計數，以1×107cells/ml濃度接種于25ml培養瓶，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。4天后首次換液，以后每3天換液一次。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞生長至 80%融合時，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1：1傳代。第一代后細胞生長達到 80%～90%時按 1：3傳代。選用生長良好的P3代細胞做鑒定。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期：取P3代細胞，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細胞懸液，并調整細胞數為1×106個，70%冰乙醇固定30 min，PBS洗2次，40mg/L RNAse中處理后離心，加入10g/L碘化丙啶0.5ml，染色30min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.3 hUCB-MSC表面標志的檢測：取P3代細胞，在細胞達到80%融合時，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細胞懸液，并調整細胞數為1×106個，PBS洗兩次，離心，棄上清，加入0.1mlPBS重懸，分別加入熒光標記的抗體及同型對照，室溫避光孵育 20min。流式細胞儀檢測CD90、CD105和CD73、CD45和CD34的表達情況。

1.2.4 hUCB-MSC分化能力檢測：①成骨誘導：取P3代細胞以5×104個/ml 接種于六孔板，用含10% FBS的 DMEM/F12 培養 24h，待細胞貼壁伸展后，實驗組換用礦化誘導液（含10nmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/ml 維生素C，1×10-7mol/L地塞米松、10% FBS的DMEM/F12培養基），對照組僅用10%FBS的DMEM/F12培養基，每隔3天換液。鏡下觀察細胞復層生長并出現黃褐色結節后棄去培養基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，1%茜素紅染色10min，鏡檢、照相；②成脂誘導：將P3代細胞以 5×104個/ml的密度接種于六孔板，用含10%FBS的DMEM/F12 培養24h，待細胞貼壁伸展后，換用成脂誘導液（含0.25μmol/L 地塞米松，0.5mmol/L IBMX，100mmo1/L 吲哚美辛，10μg/L 胰島素， 10% FBS 的DMEM/F12培養基），對照組不加誘導劑，每隔3天換液。鏡下觀察細胞內出現脂肪小滴后棄去成脂誘導液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min，油紅O染色15min，顯微鏡下觀察、照相。

2 結果

2.1 hUCB-MSC形態學觀察：原代培養初期含有多種細胞成分，大部分細胞未貼壁，細胞為圓形或球形血細胞，第4天可見散在單個細胞貼壁，呈卵圓形，紡錘形和短梭形，逐漸伸出細胞突起，但無明顯擴增；10天以后細胞體積增大，密度明顯增加，少數 MSCs 呈多角形，大部分呈長梭形，細胞突起明顯，且向周圍伸展呈輻射狀和網狀生長；細胞培養約3～4周可達80%～90%融合即可傳代。傳代hUCB-MSC接種后 6～8h即可貼壁，細胞均勻散在分布，生長迅速，1周后可再次傳代。隨著換液和傳代，異質性細胞逐漸被去除，貼壁細胞呈均一的成纖維樣細胞，呈旋渦狀生長。見圖1。

2.4 hUCB-MSC分化能力鑒定：①成骨誘導：hUCB-MSCs 成骨誘導 1周時，細胞形態變化不明顯；3周時可見鈣化物形成，茜素紅染色可見胞漿中有大量的紅色鈣化基質沉積，對照組無此變化，見圖 3；②成脂誘導：hUCB-MSCs經成脂誘導1周，生長明顯減慢， 細胞形態開始變得豐滿，胞體變大，胞漿豐富，誘導2周左右在細胞核周圍的胞漿內出現一些折光性強的圓形脂肪小滴。隨時間的延長，脂肪滴逐漸增多并融合成大脂肪滴。3周后固定，1%油紅O 染色可見細胞內有紅染脂滴，大小不等，部分脂滴發生融合，主要分布在細胞核周圍及其附近，對照組無此變化，見圖3。

3 討論

實驗在查閱大量文獻的基礎上對培養條件進行了優化，首先選用含體積分數為10%FBS的DMEM/F12作為培養基，并加入bFGF，主要考慮以往試驗中已經證明DMEM/F12能夠提高培養效率[7]，而bFGF在間充質干細胞生長的信號傳導中具有重要的作用[8]，促進間充質細胞貼壁。原代培養hUCB- MSC，主要有兩種形態的貼壁細胞：一類呈橢圓形或圓形，體積大，這類細胞不能進一步增殖達到融合，最終趨于死亡。Erices等[7]認為此類細胞可能來源于臍血的破骨祖細胞，Wexler等[9]認為這群細胞表達了造血干細胞標志，為造血干細胞來源。本實驗認為這類細胞來源于造血干細胞的可能性比較大，因為分離的單個核細胞大部分為造血干細胞，在培養中極易分化出造血系的細胞；另一類細胞呈均勻一致的長梭形，12份臍血標本有8份在第10天后出現大量MSCs，而圓形細胞很少，且MSCs增殖迅速，逐漸融合，傳代后生長也很迅速，傳3代后圓形細胞基本不見，剩下形態較為均一的漩渦樣生長的纖維樣細胞，即hUCB-MSC。流式分析顯示約近80%處于細胞周期的G0/G1期。這些細胞自我更新能力很強，表現為細胞在傳代后增殖迅速，可傳至第18代，與Goodwin 等[10]報道一致。

目前，間充質干細胞的鑒定一般有兩種方法，其一是通過表面標志物檢測，臍帶血間充質干細胞不表達或低表達造血干細胞的CDl4，CD34，CD45，不表達內皮細胞CD31，CDl44；表達CDl3，CD29，CD44，SH2（CDl05），SH3（CD73），CD90，SH4，HLA-I等[11]；另一種是從功能學上鑒定，即根據干細胞的生物學特性，在特定培養基中呈纖維細胞樣貼壁生長，表現為幼稚細胞的特性，能夠分化為至少兩種不同的子代細胞。結合上述兩種方法，本實驗中流式細胞儀檢測提示所分離培養的成纖維樣細胞表達 CD73、CD105、CD90，不表達造血細胞相關抗原 CD34、CD45，證明這些細胞是區別于造血細胞且具有高度增殖能力的處于未分化狀態的非定向干細胞。為進一步確定所純化的MSCs是否具有多向分化潛能，分別進行成骨、成脂誘導分化，結果顯示誘導3周后檢測到鈣化基質的沉淀與脂滴的形成，證明所培養MSCs具有多向分化潛能。

牙再生是利用組織工程原理形成組織、形態和功能與天然牙一樣或相似的礦化組織。其中種子細胞是牙再生的基礎與關鍵，目前牙源性干細胞為主要來源，但因其來源困難限制其應用，非牙源性干細胞如骨髓、脂肪、真皮來源的MSC逐漸被應用于牙再生研究。由于具有來源廣泛，易獲取且無倫理學限制，增殖分化能力更強等優點，目前有研究呼吁將臍血間充質干細胞作為牙再生種子細胞進行研究[12]。為此，本實驗通過體外培養建立臍血間充質干細胞系，并探討其生物學特性。實驗結果表明體外分離的hUCB-MSC為長梭狀成纖維樣細胞，表達間充質干細胞標志，體外增值活力很強，經特定條件誘導，細胞可向脂肪細胞和成骨細胞方向分化，表明建立的細胞系為MSC并具有多項分化潛能。下一步我們將利用發育期牙胚所提供的微環境誘導人臍血間充質干細胞，探討其牙向分化的可能性。hUCB-MSC可望作為種子細胞在牙齒再生組織工程學研究中有廣闊的應用前景。

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[收稿日期]2013-02-02 [修回日期]2013-03-28

編輯/張惠娟