結(jié)核病患者N－乙酰基轉(zhuǎn)移酶2基因型與異煙肼血藥濃度關(guān)系的研究

劉誠誠 金海霞 徐建 李華 朱慧 付雷 王彬 陸宇

結(jié)核病是由Mtb感染引起的，是全球流行最廣的疾病之一。Mtb可通過空氣傳播，如果不及時治療，平均每例結(jié)核病患者每年即可傳染10～15人。結(jié)核病是導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的感染性疾病之一［1］。目前全球約有20億人感染了Mtb，每年新出現(xiàn)肺結(jié)核患者約800～1000萬例，每年因肺結(jié)核死亡人數(shù)約200～300萬例，其中95%的結(jié)核病患者及98%的結(jié)核病死亡患者發(fā)生在發(fā)展中國家［2］。INH作為抗結(jié)核一線藥物，具有價廉低毒的特點(diǎn)，應(yīng)用非常廣泛。但I(xiàn)NH導(dǎo)致的肝毒性、外周神經(jīng)炎和全身性紅斑狼瘡等不良反應(yīng)與并發(fā)癥卻不容忽視。有證據(jù)表明INH的血藥濃度與藥效、不良反應(yīng)存在相關(guān)性［3］。INH在體內(nèi)的代謝存在多條通路，其主要是在N－乙酰基轉(zhuǎn)移酶2（N－acetyltransferase 2，NAT2）的作用下乙酰化為乙酰異煙肼（AcINH），后者再進(jìn)一步由酰胺酶等代謝轉(zhuǎn)化。NAT2屬于Ⅱ相解毒酶，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)26種NAT2等位基因［4］，其中存在7個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的突變，分別是191（G→A）、282（C→T）、341（T→C）、481（C→T）、590（G→A）、857（G→A）、803（G→A）［5］。282位點(diǎn)通常與590或857聯(lián)合突變，形成等位基因＊6A和＊7B，341、481、803聯(lián)合突變形成等位基因＊5B［5－7］。在亞洲和高加索人群中，最常見的導(dǎo)致慢性乙酰化表型的突變型等位基因均為NAT25B，6A，7B，這3種突變型等位基因可分別通過檢測481，590和857位的基因突變來確定。Delomenie等［8］也指出＊5B，＊6A，＊7B與慢乙酰化相關(guān)，野生型等位基因＊4與快乙酰化相關(guān)。根據(jù)以上4種等位基因可將人群代謝類型分為快速乙酰化型（rapid acetylator，RA），即野生純合型（＊4／＊4）；中間乙酰化型（intermediate acetylator，IA），即雜合子型（＊4／＊5B，＊4／＊6A，＊4／＊7B）和慢乙酰化型（slow acetylator，SA），亦稱純合突變型（含＊5B，＊6A，＊7B任意2個或3個等位基因）。INH直接由酰胺酶催化水解為酰肼（hydrazine，HZ），是INH代謝的另一條通路，HZ是構(gòu)成INH肝毒性的主要物質(zhì)。有研究指出，隨著NAT2基因突變位點(diǎn)的增加，血漿INH濃度也隨著基因型的順序改變而增加，INH的乙酰化作用減弱，水解作用反而加強(qiáng)，導(dǎo)致HZ聚集，最終引起肝功能受損［9］。

本研究探討NAT2基因的3種乙酰化基因型與INH血藥濃度之間的關(guān)系，為進(jìn)一步證實(shí)INH血藥濃度與藥效、不良反應(yīng)之間存在的相關(guān)性，以及為臨床藥物合理應(yīng)用提供依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象的納入

選擇北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所（簡稱“結(jié)研所”）2010年7月至2012年6月經(jīng)過胸部X線檢查、Mtb快速培養(yǎng)、抗結(jié)核抗體檢測，以及痰涂片陽性等確診的住院結(jié)核病患者121例，所有患者的診斷均依據(jù)參考文獻(xiàn)［10］確診；其中男60例，女61例，平均年齡（42．9±19．0）歲。住院患者INH用量均為300mg／d，連續(xù)服藥7d以上。

二、材料和儀器

1．藥品和試劑：INH（浙江南洋藥業(yè)有限公司提供）；乙腈，二甲雙胍，0．1%甲酸＋0．1%甲酸銨，去離子水（ddH2O）；Promega Wizard基因組DNA提取試劑盒（美國Promega公司），異丙醇，70%乙醇；5%TBE緩沖液，瓊脂糖；KpnⅠ、TaqⅠ、BamHⅠ酶切試劑［寶生物（大連）有限公司］。

2．儀器和設(shè)備：Thermo離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 21R），電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），BIOER（杭州博日科技有限公司）金屬浴，XW－80A漩渦混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），德國Eppendorf梯度PCR儀，ISO 9001電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，DYY－6C型電泳儀（北京六一儀器廠），Tanon－4200全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC／MS－MS）（美國安捷倫科技公司），Anke－TDL－5000B低速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

三、實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)所納入的結(jié)核病住院患者INH用量均為300mg／d，服藥2h后取肘靜脈血3ml，置于肝素抗凝管中，4℃保存30min，離心前輕輕混勻試管，吸取300μl用來提取DNA，剩余血液3000r／min，離心15min，離心半徑18cm，將上清液全部轉(zhuǎn)移至2ml EP管中，同時定量吸取100μl分裝于600μl EP管中，－80℃保存，用于INH血漿濃度測定。

1．基因型分析：應(yīng)用PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法檢測121例結(jié)核病患者的NAT2基因型分布。引物設(shè)計參考文獻(xiàn)［9］：NAT2N5（5′－tcagcctcaggtgccttgca－3′），NAT2N4（5′－agcatgaatcactctgcttc－3′）。目的片段長度為710bp，包含＊5B（G481T）、＊6A（G590A）、＊7B（G857A）3個突變位點(diǎn)。基因型酶切片段分析見表1。

表1 NAT2突變型等位基因分析

2．藥物濃度測定：采用內(nèi)標(biāo)法檢測2h后INH血藥濃度，將分裝好的100μl血清于常溫下解凍，加入二倍體積乙腈（含二甲雙胍做內(nèi)標(biāo)化合物）沉淀血清中游離蛋白和紅細(xì)胞，13 400×g，離心10min，取上清約200μl置于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC／MS－MS）進(jìn)樣器中，以內(nèi)標(biāo)法峰面積定量。液相色譜條件：ZORBAX SB－C18（2．1×100mm，1．8μm）；流動相：0．1%甲酸＋0．1%甲酸銨：乙腈（92∶8）；流率：0．3ml／min；柱溫：30℃。進(jìn)樣量：2μl。質(zhì)譜條件：采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測，氣體溫度350℃，氣流10L／min。濃度在0．1～6μg／ml時INH標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件，在服從正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用單因素方差分析檢測組間差異，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。若存在差異，進(jìn)而采用Tamhane’s T2兩兩比較法檢測每兩組間的差異，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因型分析結(jié)果

表2顯示了121例住院患者NAT2基因型分析結(jié)果，RA與IA所占比例明顯高于SA。

表2 121例結(jié)核病患者NAT2基因型分析結(jié)果

二、血藥濃度結(jié)果

表3為121例結(jié)核病住院患者服藥2h后INH血藥濃度結(jié)果均值。由此可見SA的INH血藥濃度值明顯高于RA和IA，IA血藥濃度值稍高于RA。單因素方差分析結(jié)果顯示住院患者3種基因型RA、IA、SA組間血漿INH濃度值比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（F＝26．978，v＝2，P＝0．000）；進(jìn)而進(jìn)行三組血漿INH濃度值的兩兩比較，RA與IA比較，P＝0．001；RA 與SA 比較，P＝0．002；IA 與SA比較，P＝0．000，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3 121例結(jié)核病住院患者用藥2h后NAT2各種基因分型的血漿INH濃度均值

討 論

根據(jù)Lin等［11］發(fā)現(xiàn)通過檢測＊5B、＊6A、＊7B這3個突變位點(diǎn)就基本上可以檢測出所有亞洲人和白種人群中的SA。這些突變位點(diǎn)引起酶的活性下降和酶的不穩(wěn)定性增加，從而使個體乙酰化能力受損［12］。NAT2基因多態(tài)性使得異煙肼的N－乙酰化作用能力表現(xiàn)出個體化的差異，按乙酰化能力的不同，將NAT2分為RA和SA，其多態(tài)性正是由NAT2基因多態(tài)性所決定。隨著SA機(jī)制的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)＊5B、＊6A、＊7B突變型等位基因是造成NAT2基因多態(tài)性的主要原因，可以解釋98%以上的SA。有研究證實(shí)，中國人＊5B、＊6A、＊7B等位基因的基因頻率分別是3．3%、24．6%和10．0%（合計 37．9%），突變純合子的發(fā)生率是15．8%［13］。而＊5B、＊6A、＊7B又是組成IA的主要等位基因，本實(shí)驗(yàn)121例結(jié)核病患者中IA（＊4／＊5B，＊4／＊6A，＊4／＊7B）構(gòu)成比占40．5%，接近于37．9%；SA（含＊5B，＊6A，＊7B任意2個或3個等位基因，即突變純合子）構(gòu)成比占14．0%，接近于15．8%，進(jìn)一步驗(yàn)證了＊5B、＊6A、＊7B突變等位基因與NAT2基因多態(tài)性的一致性關(guān)系。

NAT2基因型多態(tài)性是造成INH藥代動力學(xué)個體差異的重要原因。本研究結(jié)果顯示121例結(jié)核病患者中 45．5% 為 RA，40．5% 為IA，14．0% 為SA。通過分析NAT2各個基因型INH血藥濃度，筆者發(fā)現(xiàn)RA相對于IA和SA，INH濃度最低，其次是IA，SA的濃度最高，這說明隨著NAT2基因突變位點(diǎn)的增加，血漿INH濃度也隨著基因型的順序改變而增加，與此同時INH乙酰化代謝通路逐漸減弱，水解作用通路加強(qiáng)，INH在酰胺酶作用下水解為肝毒性直接相關(guān)物質(zhì)HZ，易導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝損害等不良反應(yīng)，說明NAT2基因型與INH血藥濃度在一定意義上具有相關(guān)性。因此，可以根據(jù)NAT2基因型分析結(jié)果用于指導(dǎo)INH的合理用藥，為臨床個體化治療提高療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，盡可能減少INH不良反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)使用相同劑量INH時，因個體吸收差異、年齡、體質(zhì)量、性別、病理生理狀態(tài)的差異，以及其他合并癥用藥情況等因素，再加上最重要的NAT2基因型多態(tài)性表現(xiàn)，導(dǎo)致INH血藥濃度產(chǎn)生明顯個體差異。對于SA患者采取隔日午后頓服給藥方式減少藥物的蓄積毒性；同時對于RA肝臟基礎(chǔ)較好的患者，結(jié)核癥狀較重的患者可采取每日早晨或睡前頓服給藥方式以增加藥物療效。因此，可以根據(jù)NAT2基因型檢測結(jié)果而制訂異煙肼的個體化抗結(jié)核治療方案，將大大提高異煙肼的治療效果，降低不良反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生程度。

［1］World Health Organization．Tuberculosis facts 2009update［EB／OL］．（2009－12－09）［2010－03－18］．http：／／www．who．in／tb／publications／2009／factsheet＿tb＿2009update＿dec09．pdf．

［2］任曉波，吳平，李莉，等．結(jié)核病的發(fā)病趨勢及健康教育．家庭護(hù)士，2007，5（10）：78－79．

［3］Ray J，Gardiner I，Marriott D．Managing antituberculosis drug therapy by therapeutic drug monitoring of rifampicin and isoniazid．Intern Med J，2003，33（5／6）：229－234．

［4］Hein DW，Doll MA，F(xiàn)retland AJ，et al．Molecular genetics and epidemiology of theNAT1andNAT2acetylation polymorphisms．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2000，9（1）：29－42．

［5］Zang Y，Doll MA，Zhao S，et a1．Functional characterization of single－nucleotide polymorphisms and haplotypes of human N－acetyltransferase 2．Carcinogenesis，2007，28（8）：1665－1671．

［6］Cascorbi I，Drakoulis N，Brockm?ller J，et al．Arylamine N－acetyltransferase（NAT2）mutations and their allelic linkage in unrelated Caucasian individuals：correlation with phenotypic activity．Am J Hum Genet，1995，57（3）：58l－592．

［7］Blum M，Demierre A，Grant DM，et al．Molecular mechanism of slow acetylation of drugs and carcinogens in humans．Proc Natl Acad Sci U S A，1991，88（12）：5237－5241．

［8］Deloménie C，Sica L，Grant DM，et al．Genotyping of the polymorphic N－acetyltransferase（NAT2＊）gene locus in two native African populations．Pharmacogenetics，1996，6（2）：177－185．

［9］Fukino K，Sasaki Y，Hirai S，et al．Effect of N－acetyltransferase 2 （NAT2），CYP2E1and Glutathione－S－transferase（GST）genotype on the serum concentrations of isoniazid and metabolites in tuberculosis patients．J Toxicol Sci，2008，33（2）：187－195．

［10］中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會．肺結(jié)核診斷和治療指南．中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（2）：70－74．

［11］Lin HJ，Han CY，Lin BK，et al．Slow acetylator mutations in the human polymorphic N－acetyltransferase gene in 786Asians，blacks， Hispanics，and whites：application to metabolic epidemiology．Am J Hum Genet，1993，52（4）：827－834．

［12］Takakubo F，Yamamoto M，Ogawa N，et al．Genetic association between cytochromeP450IA1gene and susceptibility to Parkinson’s disease．J Neural Transm，1996，103 （7）：843－849．

［13］陳冰，李金恒，黃晶，等．一步等位基因特異擴(kuò)增法檢測中國人N－乙酰化酶基因型．中國臨床藥理學(xué)雜志，2004，20（1）：49－52．