結核病患者N－乙酰基轉移酶2基因型與異煙肼血藥濃度關系的研究

劉誠誠 金海霞 徐建 李華 朱慧 付雷 王彬 陸宇

結核病是由Mtb感染引起的，是全球流行最廣的疾病之一。Mtb可通過空氣傳播，如果不及時治療，平均每例結核病患者每年即可傳染10～15人。結核病是導致死亡人數最多的感染性疾病之一［1］。目前全球約有20億人感染了Mtb，每年新出現肺結核患者約800～1000萬例，每年因肺結核死亡人數約200～300萬例，其中95%的結核病患者及98%的結核病死亡患者發生在發展中國家［2］。INH作為抗結核一線藥物，具有價廉低毒的特點，應用非常廣泛。但INH導致的肝毒性、外周神經炎和全身性紅斑狼瘡等不良反應與并發癥卻不容忽視。有證據表明INH的血藥濃度與藥效、不良反應存在相關性［3］。INH在體內的代謝存在多條通路，其主要是在N－乙酰基轉移酶2（N－acetyltransferase 2，NAT2）的作用下乙酰化為乙酰異煙肼（AcINH），后者再進一步由酰胺酶等代謝轉化。NAT2屬于Ⅱ相解毒酶，目前已經發現26種NAT2等位基因［4］，其中存在7個單核苷酸多態性位點的突變，分別是191（G→A）、282（C→T）、341（T→C）、481（C→T）、590（G→A）、857（G→A）、803（G→A）［5］。282位點通常與590或857聯合突變，形成等位基因＊6A和＊7B，341、481、803聯合突變形成等位基因＊5B［5－7］。在亞洲和高加索人群中，最常見的導致慢性乙酰化表型的突變型等位基因均為NAT25B，6A，7B，這3種突變型等位基因可分別通過檢測481，590和857位的基因突變來確定。Delomenie等［8］也指出＊5B，＊6A，＊7B與慢乙酰化相關，野生型等位基因＊4與快乙酰化相關。根據以上4種等位基因可將人群代謝類型分為快速乙酰化型（rapid acetylator，RA），即野生純合型（＊4／＊4）；中間乙酰化型（intermediate acetylator，IA），即雜合子型（＊4／＊5B，＊4／＊6A，＊4／＊7B）和慢乙酰化型（slow acetylator，SA），亦稱純合突變型（含＊5B，＊6A，＊7B任意2個或3個等位基因）。INH直接由酰胺酶催化水解為酰肼（hydrazine，HZ），是INH代謝的另一條通路，HZ是構成INH肝毒性的主要物質。有研究指出，隨著NAT2基因突變位點的增加，血漿INH濃度也隨著基因型的順序改變而增加，INH的乙酰化作用減弱，水解作用反而加強，導致HZ聚集，最終引起肝功能受損［9］。

本研究探討NAT2基因的3種乙酰化基因型與INH血藥濃度之間的關系，為進一步證實INH血藥濃度與藥效、不良反應之間存在的相關性，以及為臨床藥物合理應用提供依據。

對象和方法

一、研究對象的納入

選擇北京市結核病胸部腫瘤研究所（簡稱“結研所”）2010年7月至2012年6月經過胸部X線檢查、Mtb快速培養、抗結核抗體檢測，以及痰涂片陽性等確診的住院結核病患者121例，所有患者的診斷均依據參考文獻［10］確診；其中男60例，女61例，平均年齡（42．9±19．0）歲。住院患者INH用量均為300mg／d，連續服藥7d以上。

二、材料和儀器

1．藥品和試劑：INH（浙江南洋藥業有限公司提供）；乙腈，二甲雙胍，0．1%甲酸＋0．1%甲酸銨，去離子水（ddH2O）；Promega Wizard基因組DNA提取試劑盒（美國Promega公司），異丙醇，70%乙醇；5%TBE緩沖液，瓊脂糖；KpnⅠ、TaqⅠ、BamHⅠ酶切試劑［寶生物（大連）有限公司］。

2．儀器和設備：Thermo離心機（Sorvall Legend Micro 21R），電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司），BIOER（杭州博日科技有限公司）金屬浴，XW－80A漩渦混合儀（上海醫科大學儀器廠），德國Eppendorf梯度PCR儀，ISO 9001電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，DYY－6C型電泳儀（北京六一儀器廠），Tanon－4200全自動數碼凝膠成像系統（上海天能科技有限公司），液相色譜－串聯質譜儀（LC／MS－MS）（美國安捷倫科技公司），Anke－TDL－5000B低速冷凍離心機 （上海安亭科學儀器廠）。

三、實驗方案

實驗所納入的結核病住院患者INH用量均為300mg／d，服藥2h后取肘靜脈血3ml，置于肝素抗凝管中，4℃保存30min，離心前輕輕混勻試管，吸取300μl用來提取DNA，剩余血液3000r／min，離心15min，離心半徑18cm，將上清液全部轉移至2ml EP管中，同時定量吸取100μl分裝于600μl EP管中，－80℃保存，用于INH血漿濃度測定。

1．基因型分析：應用PCR結合限制性片段長度多態性（PCR－RFLP）方法檢測121例結核病患者的NAT2基因型分布。引物設計參考文獻［9］：NAT2N5（5′－tcagcctcaggtgccttgca－3′），NAT2N4（5′－agcatgaatcactctgcttc－3′）。目的片段長度為710bp，包含＊5B（G481T）、＊6A（G590A）、＊7B（G857A）3個突變位點。基因型酶切片段分析見表1。

表1 NAT2突變型等位基因分析

2．藥物濃度測定：采用內標法檢測2h后INH血藥濃度，將分裝好的100μl血清于常溫下解凍，加入二倍體積乙腈（含二甲雙胍做內標化合物）沉淀血清中游離蛋白和紅細胞，13 400×g，離心10min，取上清約200μl置于液相色譜－串聯質譜儀（LC／MS－MS）進樣器中，以內標法峰面積定量。液相色譜條件：ZORBAX SB－C18（2．1×100mm，1．8μm）；流動相：0．1%甲酸＋0．1%甲酸銨：乙腈（92∶8）；流率：0．3ml／min；柱溫：30℃。進樣量：2μl。質譜條件：采用多反應監測（MRM）方式檢測，氣體溫度350℃，氣流10L／min。濃度在0．1～6μg／ml時INH標準曲線呈良好線性關系。

四、統計學分析

應用SPSS 16．0統計軟件，在服從正態分布、方差齊性檢驗基礎上，采用單因素方差分析檢測組間差異，以P＜0．05為差異有統計學意義。若存在差異，進而采用Tamhane’s T2兩兩比較法檢測每兩組間的差異，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、基因型分析結果

表2顯示了121例住院患者NAT2基因型分析結果，RA與IA所占比例明顯高于SA。

表2 121例結核病患者NAT2基因型分析結果

二、血藥濃度結果

表3為121例結核病住院患者服藥2h后INH血藥濃度結果均值。由此可見SA的INH血藥濃度值明顯高于RA和IA，IA血藥濃度值稍高于RA。單因素方差分析結果顯示住院患者3種基因型RA、IA、SA組間血漿INH濃度值比較，差異有顯著統計學意義（F＝26．978，v＝2，P＝0．000）；進而進行三組血漿INH濃度值的兩兩比較，RA與IA比較，P＝0．001；RA 與SA 比較，P＝0．002；IA 與SA比較，P＝0．000，差異均有顯著統計學意義（表3）。

表3 121例結核病住院患者用藥2h后NAT2各種基因分型的血漿INH濃度均值

討 論

根據Lin等［11］發現通過檢測＊5B、＊6A、＊7B這3個突變位點就基本上可以檢測出所有亞洲人和白種人群中的SA。這些突變位點引起酶的活性下降和酶的不穩定性增加，從而使個體乙酰化能力受損［12］。NAT2基因多態性使得異煙肼的N－乙酰化作用能力表現出個體化的差異，按乙酰化能力的不同，將NAT2分為RA和SA，其多態性正是由NAT2基因多態性所決定。隨著SA機制的研究深入，人們發現＊5B、＊6A、＊7B突變型等位基因是造成NAT2基因多態性的主要原因，可以解釋98%以上的SA。有研究證實，中國人＊5B、＊6A、＊7B等位基因的基因頻率分別是3．3%、24．6%和10．0%（合計 37．9%），突變純合子的發生率是15．8%［13］。而＊5B、＊6A、＊7B又是組成IA的主要等位基因，本實驗121例結核病患者中IA（＊4／＊5B，＊4／＊6A，＊4／＊7B）構成比占40．5%，接近于37．9%；SA（含＊5B，＊6A，＊7B任意2個或3個等位基因，即突變純合子）構成比占14．0%，接近于15．8%，進一步驗證了＊5B、＊6A、＊7B突變等位基因與NAT2基因多態性的一致性關系。

NAT2基因型多態性是造成INH藥代動力學個體差異的重要原因。本研究結果顯示121例結核病患者中 45．5% 為 RA，40．5% 為IA，14．0% 為SA。通過分析NAT2各個基因型INH血藥濃度，筆者發現RA相對于IA和SA，INH濃度最低，其次是IA，SA的濃度最高，這說明隨著NAT2基因突變位點的增加，血漿INH濃度也隨著基因型的順序改變而增加，與此同時INH乙酰化代謝通路逐漸減弱，水解作用通路加強，INH在酰胺酶作用下水解為肝毒性直接相關物質HZ，易導致患者出現肝損害等不良反應，說明NAT2基因型與INH血藥濃度在一定意義上具有相關性。因此，可以根據NAT2基因型分析結果用于指導INH的合理用藥，為臨床個體化治療提高療效提供實驗依據，盡可能減少INH不良反應的發生。當使用相同劑量INH時，因個體吸收差異、年齡、體質量、性別、病理生理狀態的差異，以及其他合并癥用藥情況等因素，再加上最重要的NAT2基因型多態性表現，導致INH血藥濃度產生明顯個體差異。對于SA患者采取隔日午后頓服給藥方式減少藥物的蓄積毒性；同時對于RA肝臟基礎較好的患者，結核癥狀較重的患者可采取每日早晨或睡前頓服給藥方式以增加藥物療效。因此，可以根據NAT2基因型檢測結果而制訂異煙肼的個體化抗結核治療方案，將大大提高異煙肼的治療效果，降低不良反應的發生率及發生程度。

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