耐多藥結核分枝桿菌異煙肼耐藥相關基因katG突變分析

甄偉 石大偉 趙玉玲 李輝 李亮 朱國峰

異煙肼（isoniazid，INH）是一種重要的抗結核藥物，其在細菌體內被過氧化氫酶－過氧化物酶KatG氧化為乙酰異煙肼自由基和活性氧自由基等活性物質，進而攻擊結核分枝桿菌多個 靶 位 點 來 發 揮 殺 菌 作 用［1］。Zhang等［1］通 過Southern印跡雜交（Southern blot）發現結核分枝桿菌katG基因缺失和異煙肼耐藥相關。研究表明，異煙肼耐藥與許多基因相關，發生頻率最高的為katG編碼區和inhA啟動子區的突變［2－3］，katG315位突變最常見，有30%～94%的耐藥株發生該突變［2，4］，但國內對于該基因其他位點的突變研究較少。本研究通過對河南省耐多藥（multidrug resistant，MDR）結核分枝桿菌katG編碼區全長突變進行分析，進一步分析異煙肼的耐藥機制。

材料和方法

一、菌株來源

115株MDR結核分枝桿菌臨床分離株（耐多藥菌株）和22株利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素全敏感結核分枝桿菌臨床分離株（藥物敏感菌株）均來自于2007—2009年間河南省疾病預防控制中心115例新發和復發結核病患者晨痰標本。患者中男82例，女33例，年齡15～86歲。患者臨床診斷主要依據結核分枝桿菌檢測和胸部X線檢查等，確診所依據的診斷標準見參考文獻［5］。新發是指之前從未被發現或診斷為肺結核但痰涂片陽性。復發是指涂陽肺結核患者在得到有效化療后痰結核分枝桿菌轉陰，但隨病情已進入好轉期或穩定期后痰結核分枝桿菌重新復陽，同時出現活動性肺結核臨床表現或肺部X線病灶征象。藥敏實驗中所用H37Rv標準株來自于北京結核病胸部腫瘤研究所。菌株分離培養、鑒定方法及藥敏實驗的具體操作見參考文獻［5］，藥敏實驗所用藥物均購自Sigma公司。

二、結核分枝桿菌基因組DNA的提取和耐藥相關基因的PCR擴增并測序

取菌株基因組DNA，具體操作按照參考文獻［6］進行。采用Phusion DNA聚合酶（Finnzymes，Finland）擴增katG基因。katG基因編碼區全長分兩段進行擴增和測序。PCR擴增體系：采用50μl體系進行PCR檢測，反應體系為：基因組 DNA 模 板 3μl，緩 沖 液 （buffer）10μl，二 甲 基 亞 砜（DMSO）1．5μl，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2μl，引物各0．5μl，DNA聚合酶0．5μl，ddH2O 32μl。反應循環條件為：預變性：98℃30s，98℃ 10s，65℃ 10s，72℃ 1min，35個循環；72℃延伸7min。測序引物序列見表1。有5株MDR菌株未得到可用于測序分析的PCR產物，因此可進行katG突變分析的菌株總數為110株。由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測序。

三、測序數據的分析

應用軟件SeqMan Pro（version 7．1，DNAstar Lasergene Inc，USA）將測序數據與參比序列進行比對分析。參比序列為結核分枝桿菌H37Rv的katG序列。比對后，若實驗菌株的DNA序列與參比序列相同，則未發生突變；若不同，則為發生突變，并記錄突變位點的具體類型和頻率。

結 果

一、耐多藥菌株和藥物敏感菌株katG基因突變概況

1．耐多藥菌株katG突變概況：在110株MDR結核分枝桿菌中均檢測到katG基因突變（表2），突變位點有40個（以密碼子編號計算），其中同義突變為katG24和katG390。在結核分枝桿菌耐藥相關基因突變和多態性數據庫（www．tbdreamdb．com）中檢索上述40個突變位點，有19個突變位點未見記錄（包括同義突變katG24），有6個突變類型未見記錄（包括同義突變katG390）。

表1 katG基因PCR擴增和測序相關信息

表2 異煙肼耐藥相關基因katG突變特征（按突變位點組合分析）

2．異煙肼敏感對照菌株katG突變概況：22株藥物敏感株中，僅在463位密碼子發現了突變，數目為20株，其他位點未檢測到突變。

二、異煙肼耐藥菌株katG基因突變類型和頻率

具體見表2。除去僅有同義突變或katG463突變的菌株9株，共101株MDR結核分枝桿菌發生katG基因突變，占91．8%（101／110），其中發生katG315突變的菌株最多，有68株，占61．8%（68／110），發生katG其他位點突變的菌株33株，占30．0%（33／110）。89．7%（61／68）的katG315突變為AGC→ACC （Ser→Thr），其余為 AGC→AAC （Ser→Asn）。單獨發生katG315突變的有4株，katG315聯合katG463突變的有54株，其余10株均發生katG315、katG463和第三個位點的聯合突變；其次是katG428，有4株發生該突變，占3．6%（4／110），但這4株同時也發生katG315突變；發生其他單點突變菌株數目較少，為1或2株，但總數較大，共33株。

討 論

研究表明，50%以上異煙肼耐藥株發生katG315突變，突變頻率存在地區、研究群體的差異［7－10］。本研究中有61．8%（68／110）的菌株發生katG315突變，明顯低于俄羅斯（93．6%）［9］和巴西（87．1%）［11］，與中國東部（64．4%）［12］和北京（60．6%）［13］接近，高于中國香港（41．5%）［14］。MDR菌株對該突變的選擇壓力可能是造成此差異的原因之一，在中國東部5省的一項研究中，單耐異煙肼的結核分枝桿菌中有64．4%發生katG315突變［12］，低于同樣在中國東部開展但針對MDR結核分枝桿菌的研究所報道的突變頻率（72．7%，176／242）［15］。

本研究中katG基因各位點總突變率為91．8%（101／110），與現有報道無明顯差別［12］。katG315最主要突變類型是 AGC→ACC（89．7%，61／68），與多數研究一致［7－8，16］。本研究中，發生katG463突變菌株數目為103株，但對照菌株也發現該突變，這顯示該突變為多態性位點，多分布在亞洲、俄羅斯［17－18］，可 能 與 異 煙 肼 耐 藥 無 關［19－20］。 但 目 前 關 于 該位點和異煙肼耐藥關聯與否存在爭論。有研究表明具有katG463突變的結核分枝桿菌表現出和野生型相同的過氧化物－過氧化氫酶活性［21］，且該位點突變不能改變其酶活性［22］，但同時有研究發現該位點與低 水平耐藥有關［12，22］。除去同義突變和多態性位點katG463，本研究中突變頻率katG428為3．6%（4／110），列第二位。目前為止，該突變未見其他文獻報道，且這4株菌同時也發生katG315突變，推測該位點對異煙肼耐藥可能不起主要作用。

目前認為結核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子機制涉及katG、inhA啟動子區、ahpC、oxyR等多個基因，為了達到較高的靈敏度，異煙肼耐藥性分子檢測也通常基于多個基因及其突變的聯合檢測。研究顯示在檢測katG315突變的基礎上，聯合檢測inhA－15可以增加8．3%的異煙肼耐藥預測靈敏度，聯合檢測ahpC－10可以增加3．7%的靈敏度［15］。本研究通過對katG基因編碼區全長進行分析，發現katG基因315位點外的低頻單點突變廣泛存在于異煙肼耐藥結核分枝桿菌中，但在22株敏感對照菌株中并沒有發現這些突變，提示這些突變可能與異煙肼耐藥相關，但仍需要更大樣本的菌株群體檢測，來驗證這些突變與異煙肼耐藥性的關系。本研究中發現除katG315之外的39個突變位點，其中7個位點與katG315聯合突變。Chan等［14］在中國香港的一項研究中也對katG基因全長進行了測序分析，得到katG315外的31個低頻單點突變位點（其中有7個位點與katG315聯合突變），30個突變位點與異煙肼耐藥相關，有3個位點（katG155、katG127、katG289）在本研究中也發現相同突變。

綜上所述，katG315外的katG基因其他突變位點可能在異煙肼耐藥分子機制中存在作用，但仍需在更大樣本的菌株群體中和通過體外遺傳操作來驗證。而對于異煙肼耐藥性的預測，通過檢測katG基因編碼區全長的突變可以獲得與檢測多個基因的突變相似的高靈敏度。

［1］Zhang Y，Heym B，Allen B，et al．The catalase－peroxidase gene and isoniazid resistance ofMycobacteriumtuberculosis．Nature，1992，358（6387）：591－593．

［2］Mokrousov I，Otten T，Filipenko M，et al．Detection of isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisstrains by a multiplex allele－specific PCR assay targetingkatGcodon 315variation．J Clin Microbiol，2002，40（7）：2509－2512．

［3］Banerjee A，Dubnau E，Quemard A，et al．inhA，agene encoding a target for isoniazid and ethionamide inMycobacterium tuberculosis．Science，1994，263（5144）：227－230．

［4］Kim SY，Park YJ，Kim WI，et al．Molecular analysis of isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosisisolates recovered from South Korea．Diagn Microbiol Infect Dis，2003，47（3）：497－502．

［5］中國防癆協會．結核病診斷細菌學檢驗規程．中國防癆雜志，1996，18（1）：28－31．

［6］van Soolingen D，Hermans PW，de Haas PE，et al．Occurrence and stability of insertion sequences inMycobacterium tuberculosiscomplex strains：evaluation of an insertion sequencedependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis．J Clin Microbiol，1991，29（11）：2578－2586．

［7］Musser JM，Kapur V，Williams DL，et al．Characterization of the catalase－peroxidase gene（katG）andinhAlocus in isoniazid－resistant and－susceptible strains ofMycobacterium tuberculosisby automated DNA sequencing：restricted array of mutations associated with drug resistance．J Infect Dis，1996，173（1）：196－202．

［8］Haas WH，Schilke K，Brand J，et al．Molecular analysis ofkatGgene mutations in strains ofMycobacterium tuberculosiscomplex from Africa．Antimicrob Agents Chemother，1997，41（7）：1601－1603．

［9］Mokrousov I，Narvskaya O，Otten T，et al．High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisclinical isolates from northwestern Russia，1996to 2001．Antimicrob Agents Chemother，2002，46（5）：1417－1424．

［10］Marttila HJ，Soini H，Eerola E，et al．A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug－resistantMycobacterium tuberculosisisolates originating from the St．Petersburg area in Russia．Antimicrob Agents Chemother，1998，42（9）：2443－2445．

［11］Silva MS，Senna SG，Ribeiro MO，et al．Mutations inkatG，inhA，andahpCgenes of Brazilian isoniazid－resistant isolates ofMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，2003，41（9）：4471－4474．

［12］Zhang M，Yue J，Yang YP，et al．Detection of mutations associated with isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosisisolates from China．J Clin Microbiol，2005，43 （11）：5477－5482．

［13］Jiao WW，Mokrousov I，Sun GZ，et al．Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistantMycobacterium tuberculosisstrains from Beijing，China．Chin Med J（Engl），2007，120（9）：814－819．

［14］Chan RC，Hui M，Chan EW，et al．Genetic and phenotypic characterization of drug－resistantMycobacterium tuberculosisisolates in Hong Kong．J Antimicrob Chemother，2007，59（5）：866－873．

［15］Luo T，Zhao M，Li X，et al．Selection of mutations to detect multidrug－resistantMycobacterium tuberculosisstrains in Shanghai，China．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：1075－1081．

［16］菅記涌，王嫩寒，易俊莉，等．MTBDR plus方法快速檢測北京地區臨床結核分枝桿菌分離株利福平和異煙肼耐藥性效果評價．中國防癆雜志，2010（10）：611－614．

［17］Lee AS，Tang LL，Lim IH，et al．Lack of clinical significance for the common arginine－to－leucine substitution at codon 463 of thekatGgene in isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisin Singapore．J Infect Dis，1997，176（4）：1125－1127．

［18］Kurepina NE，Sreevatsan S，Plikaytis BB，et al．Characterization of the phylogenetic distribution and chromosomal insertion sites of fiveIS6110elements inMycobacterium tuberculosis：non－random integration in the dnaA－dnaN region．Tuber Lung Dis，1998，79（1）：31－42．

［19］van Doorn HR，Kuijper EJ，van der Ende A，et al．The susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto isoniazid and the Arg→Leu mutation at codon 463ofkatGare not associated．J Clin Microbiol，2001，39（4）：1591－1594．

［20］Herrera L，Valverde A，Saiz P，et al．Molecular characterization of isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisclinical strains isolated in the Philippines．Int J Antimicrob Agents，2004，23（6）：572－576．

［21］Johnsson K，Froland WA，Schultz PG．Overexpression，purification，and characterization of the catalase－peroxidase KatG fromMycobacterium tuberculosis．J Biol Chem，1997，272（5）：2834－2840．

［22］Rouse DA，DeVito JA，Li Z，et al．Site－directed mutagenesis of thekatGgene ofMycobacterium tuberculosis：effects on catalase－peroxidase activities and isoniazid resistance．Mol Microbiol，1996，22（3）：583－592．