TH17細胞、IL－21因子在鼠肺纖維化中的表達及意義

于永江，李樹民，鮑文華，梁建合，閻紅娥，孫云暉

（佳木斯大學附屬第一醫院 呼吸內科，黑龍江 佳木斯154002）

肺纖維化是一種復雜的進行性病變，致病因素多、步驟復雜，基本上是不可逆的病理改變［1，2］。目前治療方法有限，預后差，死亡率高，被稱為不是腫瘤的腫瘤。病因及發病機制尚不清楚，國外學者研究提示，多種炎癥因子可能參與了肺纖維化的發生、發展［3］。最近發現的一種新的效應性CD4＋T細胞亞群Th17細胞，以分泌IL－17為特征性細胞因子，還可分泌IL－21、IL－22和IL－26等多種細胞因子，在防御細菌的胞外感染、介導慢性炎癥和自身免疫性疾病、腫瘤等過程中發揮重要作用［4，5］。IL－21對 T細胞、B細胞、NK細胞和DC等免疫細胞發揮作用，參與機體的獲得免疫與天然免疫［6］。我們前期工作發現Th17細胞及IL－17參與肺纖維化動物模型的發病過程。本次實驗檢測博來霉素致大鼠肺纖維化模型不同發病階段肺組織中Th17細胞、IL－21因子表達水平，探討在其發病過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠64只，雌雄各半，體質量（210±20）g，3－4月齡，由大連醫科大學動物部提供，許可證號：動物合格證號ISCXK（遼）2008－0002分籠飼養于SPF級環境中。

1．1．2 試劑和儀器 注射用鹽酸BLM，15mg／支，日本化藥株式會社生產 ；HYP試劑盒購于天津市金圣生物試劑公司；IL－21的引物由上海生物工程有限公司合成，如下所示：beta－actin（784bp）：上游5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 5′－GAGCCAGGGCAGTAATCTCC－3′；IL－21 （142 bp）上游 5′－CCTCAGCTGTGCCAACAAGTC－3′，下 游 5′－TCCTGAACTTCTAACAGCTCCACA－3′；大鼠抗小鼠單克隆流式抗體 APC Mouse Anti－Rat CD3、PerCP Mouse Anti－Rat CD8a、抗大鼠／小鼠單克隆抗體 Anti－Mouse／Rat IL－17AFITC 及同型對照、固定／破膜劑、Lysing Buffer溶血素（美國BD Pharmingen公司）均購于北京利文公司；膠原酶ⅤCollagenaseⅤ、離子霉素、PMA（美國Sigma公司）均購于北京利文公司。

1．2 方法

實驗分組與造模：采用隨機數字法將64只SD大鼠均分為N、P、D 3組。P、D組均采用一次性氣管內注射博來霉素（5mg／kg）方法建立大鼠肺纖維化模型。對照組氣管內灌注等量0．9%氯化鈉注射液。D組從第7天開始每日腹腔注射地塞米松注射液（3mg／kg），N、P組腹腔注射0．9%氯化鈉注射液。

1．2．1 標本取材 分別于造模第7、14、28天每組隨機取8只大鼠處死，留取左肺分為兩份，一份通過蘇木精－伊紅染色（HE）觀察肺組織病理變化和 另一份取20mg肺組織 檢測其HYP含量，取右肺組織，留取80mg肺組織采用膠原酶Ⅴ消化法制備肺組織單細胞懸液，采用流式細胞技術檢測Th17細胞百分比。另取右肺組織100mg，放入－196℃液氮中保存，用于RT－PCR評估IL－21mRNA的表達水平。

1．2．2 采用堿水解法測定肺組織HYP含量 嚴格按照試劑盒說明書進行。

1．2．3 流式細胞分析法檢測肺組織中Th17 ①采用膠原酶Ⅴ消化法制備濃度1．0－3．0×107個／L肺單細胞懸液。②刺激培養淋巴細胞：加：PMA（50 μg／ml）、離子霉素Ionomycin（lug／ml），BFA（1μg／ml）；（37℃、5%CO2、孵育5h）③收獲細胞，細胞膜表面染色：用抗鼠CD3＋、CD8＋抗體60μl／份樣本、染色，室溫避光15min；加入2ml PBS洗滌離心去上清。④破膜通透：加入0．25ml破膜劑混勻10 min后終止破模；加PBS0．5ml上機觀察CD3＋CD8－細胞數；如果數量較為理想，取4萬細胞做陰性對照，離心去上清。⑤加PE標記的抗人IL－17，室溫避光孵育30min，洗滌后上機；⑥根據前向散射光和側向散射光以淋巴細胞群設門，設置各通道之間的熒光補償后，對Thl7細胞的比例進行檢測。

1．2．4 RT－PCR肺組織IL－21mRNA 的表達 提取肺組織總RNA，反轉錄為cDNA。目的基因IL－21mRNA 的 上 游 引 物：5′－CCTCAGCTGTGCCAACAAGTC－3′，下 游 引 物 5′－TCCTGAACTTCTAACAGCTCCACA－3′擴增片段142bp；內參照 B－Actin mRNA 上 游 引 物：5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 引 物 5′－GAGCCAGGGCAGTAATCTCC－3′，產 物 長 度 784bp。PCR反應條件按試劑說明進行。凝膠成像系統，Total Lab圖像分析系統測定各組IL－21mRNA反轉錄擴增條帶的積分吸光度值。

1．2．5 統計學方法 采用SPSS19．0統計軟件進行分析。實驗結果以均數±標準差（ˉx±s）表示。多組均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD－t檢驗，檢驗水準α＝0．05，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 大鼠的組織病理學改變及羥脯氨酸含量變化

2．1．1 HE染色 N組病理切片顯示大鼠肺組織結構無異常，間質未發現膠原沉積。造模第7d，P組大鼠肺組織顯示明顯的肺泡炎，有大量炎性細胞滲出肺泡腔，有少量膠原沉積于肺間質；模型組第14d，P組肺泡炎減輕，成纖維細胞增生、膠原沉積、肺泡間隔增寬，肺泡腔縮小。模型組第28d，P組肺纖維化形成穩定，有部分炎癥細胞浸潤。D組也出現從肺泡炎到肺纖維化的變化過程，但變化程度同一時間點較P組輕（P＜0．05），見圖1。

2．1．2 大鼠肺組織中羥脯氨酸含量變化 N組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量隨時間變化無改變。P組和D組大鼠肺組織內羥脯氨酸含量隨時間延長逐漸增加。P、D組羥脯氨酸含量均高于N組（P＜0．05），相同時間點，D組羥脯氨酸含量低于P組（P＜0．05），見表1。

圖1 大鼠肺組織病理學改變

表1 大鼠肺組織羥脯氨酸含量（ˉx±s，mg／g）

2．2 大鼠肺組織中Th17細胞的比例

N組大鼠肺組織中Th17的比例隨時間變化無改變。P組大鼠肺組織內Th17的比例在第7天最高，此后逐漸下降。P、D組Th17的比例均高于N組（P＜0．05），D組Th17的比例低于P組，見表2。

表2 大鼠肺組織中的CD3＋CD8－IL－17＋Th17細胞百分率 （%）

2．3 大鼠肺組織中IL－21mRNA的表達

N組大鼠肺組織中IL－21的表達水平隨時間變化無改變。P組大鼠肺組織中lL－21的表達水平在第7天最高，此后逐漸下降。P、D組IL－21的表達水平均高于 N組（P＜0．05），D組IL－21的表達水平低于P組（P＜0．05），見表3、圖2。

表3 大鼠肺組織中IL－21的表達水平

圖2 大鼠肺組織中IL－21的表達水平

3 討論

本研究制造大鼠肺纖維化模型，采用當前在國際上廣泛采用氣管內注入BLM的實驗方法［7］，因HYP含量能反映膠原代謝情況，故測定組織中HYP含量，可以判斷纖維化程度［8］。本次研究結果發現：肺組織病變早期表現以肺泡的炎癥反應為主，晚期表現以纖維化組織增生和細胞外基質沉積為主；實驗模型組及藥物干預組大鼠肺組織HYP含量的結果隨時間逐漸升高，結果與文獻［9，10］報道一致，提示本實驗動物模型制備均成功。

為探討Th17細胞及IL－21在肺纖維化中的表達及其意義，實驗采用流式細胞術檢測Th17細胞比率及RT－PCR半定量檢測IL－21在博來霉素致大鼠肺纖維化模型中的動態表達。結果發現，P組肺組織中Th17細胞比率及IL－21的表達水平均高于N組（P＜0．05），尤其在第7天肺泡炎階段Th17細胞及IL－21水平達高峰。P組肺組織中Th17細胞的比率高于N組與文獻報道［11］相一致，但高峰提前。提示Th17細胞及IL－21可能與肺纖維化形成過程中的炎癥損傷及纖維化形成關系密切。其可能機制：Th17細胞通過其分泌的IL－17來發揮強致炎作用［12］。IL－21形成自分泌環，誘導 Th17細胞分泌IL－21，IL－21促進CD4＋T分化為 Th17細胞［13］。IL－21直接激活NK細胞，經過JAK－STAT3信號通路，促進其細胞增殖和分化，從而發揮殺傷感染病毒細胞的作用，激活的NK細胞分泌細胞因子，細胞因子又能激活NK細胞，使其功能進一步增強，形成正反饋，同時單核－巨噬細胞被激活，其殺傷和吞噬病原菌的作用是通過ROIS和iNOS實現，因分泌大量細胞因子致炎癥細胞聚集在感染部位，使炎癥反應加強［14］。IL－21表達減少的小鼠，肺部炎癥及纖維化減輕，表明IL－21促進肺部炎癥和纖維化［15］。

本研究發現在應用糖皮質激素的D組，Th17細胞及IL－21水平的表達水平及變化趨勢與P組相同，表達水平明顯下降。可能的作用機制：糖皮質激素是一種強效免疫抑制劑，可以抑制多種細胞因子的合成與分泌［16］，降低免疫復合物水平和阻止多種有免疫效應的細胞功能，從而減少IPF的肺泡炎癥和纖維化［17］。本研究提示：糖皮質激素可能通過抑制IL－21因子的表達從而減少Th17細胞的分泌的細胞因子，從而減輕炎癥反應，抑制肺纖維化的進展。

本實驗在動物水平研究關于Th17細胞及IL－21在肺纖維化中的作用和機制。實驗動物與人類的發病機制基本相同但是還存在差異，應進一步行臨床實驗研究，為肺纖維化的治療提供理論依據。

［1］楊梁梓，張濟州，呂路艷，等．肺纖維化的研究進展［J］．云南中醫中藥雜志，2010，31（8）：74．

［2］Coward WR，Saini G，Jenkins G，et al．The pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Ther Adv Respir Dis，2010，4（6）：367．

［3］Raghu G，Collard HR，Egan JJ，et al．An Official ATS／ERS／JRS／ALAT Statement：idiopathic pulmonary fibrosis：evidencebased guidelines for diagnosis and management［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788．

［4］Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al．IL－17and Th17Cells Annu［J］．Rev immunol，2009，27：485．

［5］Hawing ton LE，M angan PR，W eaver CT，et al．Expanding the effector CD4＋T cell repertoire the Th17lineage CurrO pin［J］．immunol，2006，18（3）：349．

［6］Rosanne Spolski，Warren J．Leonard Interleukin－21：Basic biology and implications for cancer and autoimmunity［J］．Annu Rev Immunol，2008，26：57．

［7］Moriya Y，Sut；ihara K，Akasu T，et al．Importance of‘xtcndcd Lymph－adencdctomv woth lateral node dissection for advanced lower rectal cancer［J］．World J Surt，2004，21（9）：728．

［8］張 霞，歐陽學農，李曉冬，等．腸癌組織中TIP30基因的表達與轉移預后間的關系及機制［J］．第一軍醫大學學報，2005，26（5）：488．

［9］Borensztajn K，Bresser P，van der Loos C，et al．Protease－activated receptor－2induces myofibroblast differentiation and tissue factor up－regulation during bleomycin－induced lung injury：potential role in pulmonary fibrosis［J］．Am J Pathol，2010，177（6）：2753．

［10］Gupte W，Ramasamy SK，Reddy R，et al．Overexpression of fibroblast growth factor－10during both inflammatory and fibrotic phases attenuates bleomycin－induced pulmonary fibrosis in mice［J］．Am J Respir Crit Care Med，2009，180（5）：424．

［11］董紹興，邰文琳，王殿華，等．IL－17在博來霉素致小鼠肺纖維化形成中的表達［J］．西安交通大學學報，2012；33（2）：199．

［12］Happel KI，Zheng M，Younq E，et al．Cutting edge：roles of Toll－like receptor 4and IL－23in IL－17expression in response to Klebsiella pneumoniae infection［J］．J Immunol，2003，170（9）：4432．

［13］Korn T，Bettelli E，Gao W，et al．IL－21initiates an alternative paThway to induce proinflammatory Th17cells J［J］．J Nature，2007，448：484．

［14］Xu lin．Immunoregulatory Function of IL－21［J］．International Journal of Immunplogy，2006，29（6）：354．

［15］Pesce J，Kaviratne Aviratne M，Ramalingam T R，et al．TheIL－21receptor augments Th2effector function and alternative macrophage ac－tivation［J］．J Clin lnvest，2006，116（7）：2044．

［16］彭麗萍，左夢華，遲寶榮，等．甲基強地松龍治療肺間質纖維化前后TNF－a和IL－8的變化［J］．吉林大學學報：醫學版，2004，30（2）：286．

［17］Walter N，Collard HR，King TE Jr，et al．Current perspectives on the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：330．