水稻突變體Shuanglimi的光合特性

摘要：以水稻突變體Shuanglimi為試驗材料，對其幼穗處于減數(shù)分裂期時劍葉的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、 葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、水分利用率（WUE）和羧化效率（CE）、葉綠素含量及劍葉中維管束數(shù)目進行了測定和觀察。結(jié)果表明，Shuanglimi 的Pn、WUE和CE較CK分別降低了（71.18±2.08）%， （72.00±2.51）%和（79.33±3.27）%（P<0.01），而其Tr和Ci與CK之間無顯著差異。Shuanglimi總?cè)~綠素含量較CK降低，尤其是葉綠素b含量大幅降低。同時，Shuanglimi劍葉中小維管束的數(shù)目較CK降低了（18.86±1.97）%（P<0.01），而大維管束中含有3個和4個導(dǎo)管的特異變化數(shù)目較CK明顯增加。由此可見，Shuanglimi的光合特性差異是其子粒和生殖特性差異形成的原因之一。

關(guān)鍵詞：水稻突變體Shuanglimi；光合作用；葉綠素含量；維管束

中圖分類號：S511.2+1；Q945.11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2250-04

在水稻的遺傳改良進程中，豐富多彩的遺傳性變異個體為優(yōu)良新種質(zhì)的篩選與培育提供了廣泛的種質(zhì)資源。現(xiàn)代生物技術(shù)在提高變異頻率，擴大變異圖譜，縮短篩選周期、豐富變異類型等方面發(fā)揮著十分重要的作用[1]。在變異材料的創(chuàng)造過程中，各種突變體的出現(xiàn)為水稻的遺傳改良提供了有利的資源材料。在水稻突變體中，花器官突變體已成為當(dāng)今植物發(fā)育生物學(xué)和植物功能基因組學(xué)研究的焦點和熱點。光合作用是將無機物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)并將太陽光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，它是水稻最基本的生理活動以及生長和發(fā)育的原動力。光合作用效率是直接影響水稻生產(chǎn)力及產(chǎn)量高低的重要因素之一，是水稻遺傳改良中重要的考查指標[2]。在此項研究中，水稻突變體Shuanglimi是利用離子束介導(dǎo)技術(shù)對秈稻進行遺傳改良時在其后代中篩選到的一種表現(xiàn)出“雙粒米”特性的花器官突變體。經(jīng)過5個世代的純化，該突變體已經(jīng)穩(wěn)定，田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)一致，但其子粒性狀按照一定的頻率發(fā)生分離。以水稻突變體Shuanglimi為試驗材料，對其生殖生長期的光合作用以及與其相關(guān)的細胞結(jié)構(gòu)進行了研究，旨在掌握水稻突變體Shuanglimi的光合特性，為進一步研究其生殖特性和完善水稻突變體庫提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2006年，利用氮離子束介導(dǎo)技術(shù)將玉米（西星赤糯1號）DNA轉(zhuǎn)化到受體材料IR36（CK）中，在其當(dāng)代群體中產(chǎn)生了1株具有“雙粒米”特性的突變體。此突變體經(jīng)過5個世代的純化和篩選后獲得了遺傳上穩(wěn)定的株系。該株系的主要農(nóng)藝性狀整齊一致，穎殼比較長且呈開穎狀態(tài)，群體中大部分穎花表現(xiàn)為高度不育，而少部分穎花可實現(xiàn)自交結(jié)實，由此可以分離出雙粒米子粒（圖1）。根據(jù)其子粒特性，此突變體被命名為Shuanglimi。細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Shuanglimi產(chǎn)生“雙粒米”的原因是小穗分化時形成雙子房，故此突變體是一種雙子房花器官突變體。為了進一步系統(tǒng)地研究該突變體的生理特性，2012年5月將試驗材料種植于河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的試驗田中， 采用常規(guī)管理，在生殖生長期對其光合特性進行了研究與分析。在突變體創(chuàng)造過程中，供體玉米來自于山東省萊州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，受體材料來自于實驗室多年采用的具有穩(wěn)定遺傳基礎(chǔ)的試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 光合作用參數(shù)的測定 在水稻處于生殖生長期，當(dāng)劍葉葉耳與倒二葉葉耳相平時（此時幼穗發(fā)育正處于減數(shù)分裂期），兩種試驗材料各選擇30株長勢均一、生長良好的單株。按照楊秋云等[3]的方法，選擇晴朗的天氣，上午10∶30，借助Li-6400光合作用測定儀采用開路測量法對其劍葉中部進行光合作用參數(shù)測定。對于同一單株連續(xù)測量3 d，視為3次重復(fù)。

1.2.2 葉綠素含量的測定 葉綠素含量的測定采用化學(xué)方法[4]。稱取0.5 g 新鮮的劍葉剪碎放入研缽，加入少量的石英砂和碳酸鈣及5 mL純丙酮，充分研磨成勻漿，再加入80%丙酮5 mL，在暗處靜置10 min，充分提取色素。過濾，用乙醇定容到25 mL，搖勻。以95%的乙醇為空白對照，利用紫外-可見分光光度計分別在663 nm和645 nm處測其吸光度，3次重復(fù)。

1.2.3 大、小維管束觀察 參照李金才等[5]的方法選取合適的劍葉利用FAA固定液進行固定，分別用蘇木精、番紅和固綠染色，然后按照標準制蠟方法制備蠟塊[6]。蠟塊制備完畢，用手動切片機進行切片，切片厚度為8 μm，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察、檢片、統(tǒng)計和拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

每次試驗3次重復(fù)，取其平均值， 并用SPSS 13.0對突變體材料與對照之間的差異進行t 檢驗（P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著）。用Photoshop CS2進行圖片的組合與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Shuanglimi劍葉光合作用參數(shù)的變化

Shuanglimi光合作用的指標由凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）、水分利用率（WUE）和羧化效率（CE）等6個相關(guān)參數(shù)組成（表1）。從表1可以看出，Shuanglimi的Pn較CK降低（71.18±2.08）%（P<0.01），而其Gs高出CK近1倍（P<0.05）。同時，Shuanglimi的WUE和CE較CK分別降低了（71.99±2.51）%（P<0.01）和（79.33±3.27）%（P<0.01）。然而，Shuanglimi的Tr和Ci與CK之間無顯著差異。羧化效率（CE）可以反映葉片對進入葉片細胞間隙CO2的同化狀況。羧化效率越高，說明光合作用對CO2的利用效率越高。從上面分析來看，Shuanglimi的光合效率和羧化效率遠低于CK，這可能是Shuanglimi生長勢弱于CK的原因之一。

2.2 Shuanglimi葉綠素含量的變化

Shuanglimi的葉綠素含量顯著低于CK（表2），Shuanglimi 的葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素分別較CK降低了（12.39±1.47）%（P<0.05），（95.56±2.64）%（P<0.01）和（42.13±1.83）%（P<0.05），表明Shuanglimi 的葉綠素總體降低，尤其是葉綠素b最為缺乏。然而Shuanglimi 的Chla/Chlb卻極顯著地高于CK（P<0.01），表明Shuanglimi中葉綠素主要是以葉綠素a為主，這可能是造成Shuanglimi中葉片顏色較CK明顯變淺和光合效率降低的一個主要原因。

2.3 Shuanglimi劍葉中維管束的變化

Shuanglimi劍葉橫切面中維管束的特征與CK之間有較大的差異。從圖2可以看出，在整個劍葉的橫切面中存在著大維管束和小維管束，大維管束分布在小維管束之間。在Shuanglimi中，維管束染色較淺，不易觀察，而CK中的維管束染色較深，容易觀察（圖2A、圖2B）。在劍葉的中脈由多個維管束和一些薄壁細胞組成，中間有大而分隔的空腔。Shuanglimi空腔的面積明顯小于CK，且空腔周圍的維管束數(shù)目同樣少于CK（圖2C、圖2D）。在每個大維管束中，導(dǎo)管的數(shù)目存在著一定的差異。在CK中，每個大維管束中的導(dǎo)管主要有2個，也有1個和3個導(dǎo)管出現(xiàn)（圖3A、圖3B）。然而，在Shuanglimi中，雖然每個大維管束中的導(dǎo)管還是以2個為主，但是1個、3個和4個導(dǎo)管的情形頻繁出現(xiàn)（圖3C至圖3F）。從統(tǒng)計分析結(jié)果（表3）來看，在整個劍葉的橫截面中，Shuanglimi和CK的大維管束數(shù)量相近，而Shuanglimi的小維管束數(shù)目較CK降低了18.86%（P<0.01）。Shuanglimi中1個導(dǎo)管的大維管束數(shù)目與CK十分接近，而其2個導(dǎo)管的大維管束數(shù)目較CK減少了17.89%（P<0.05）。同時，Shuanglimi中3個導(dǎo)管的大維管束數(shù)目較CK高出1倍多。然而，4個導(dǎo)管的大維管束在Shuanglimi中平均含有（0.333±0.018）個，而在CK中則無此種特異情況存在。

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究的具有雙子房的突變體有mp1、mp2[7]、tom-1[8]、TOR[9]和PRR16[10]等。研究者發(fā)現(xiàn)mp1和mp2雄蕊數(shù)目增多，內(nèi)外稃間有2個谷粒；tom-1雙子房兩側(cè)各有一個完整外穎，內(nèi)穎退化成針狀，產(chǎn)生雙粒米種子；TOR 突變體多為融合雙子房，雄蕊數(shù)目減少，雌蕊數(shù)目增多，有雄蕊雌蕊化現(xiàn)象，穎片、漿片無變異， 個別無內(nèi)稃， 每個穎花只產(chǎn)生一粒種子， 可以認為只發(fā)生了第3、4 輪花器官的變異；PRR16的雄蕊增多，有多余的穎片，產(chǎn)生雙粒或3粒種子。雖然上述突變體均具有雙子房性狀， 與此次報道的Shuanglimi類似， 但也存在顯著差異。水稻突變體Shuanglimi雄蕊數(shù)目少，存在雄蕊退化并直接發(fā)育成枝粳的現(xiàn)象，同時雙子房兩側(cè)各有一完整外穎，內(nèi)穎退化，它是集中了tom-1和TOR的發(fā)育特點。由此認為水稻突變體Shuanglimi可能是一種新的雙子房突變體。

此次以這種新的雙子房突變體Shuanglimi為試驗材料，研究了影響其特異發(fā)育的光合特性及與其相關(guān)的細胞結(jié)構(gòu)。對Shuanglimi的光合作用分析表明在幼穗進行減數(shù)分裂期間，除Tr和Ci與CK無顯著差異外，Shuanglimi的劍葉凈光合效率、水分利用率以及羧化效率均比CK大幅度降低，而氣孔導(dǎo)度卻提高了近1倍。這說明在蒸騰作用和胞間CO2濃度變化不大的情況下，在Shuanglimi中由于水分利用率以及羧化效率均比較低，盡管氣孔導(dǎo)度有所增加，但其凈光合速率仍然很低。這說明Shuanglimi光合效率較弱的原因可能是由自身特殊的細胞結(jié)構(gòu)所決定的，這也可能是Shuanglimi小穗形成過程中特異發(fā)育的一個誘因。從細胞結(jié)構(gòu)分析來看，Shuanglimi光合作用比較弱的原因可能有以下兩點：①Shuanglimi的總?cè)~綠素含量較對照降低，尤其是葉綠素b含量大幅減少。作為光合作用主要的捕光色素，葉綠素b含量的降低直接影響了羧化效率，進而削弱光合效率。②Shuanglimi劍葉中維管束的特異性間接影響了光合作用。與CK相比，Shuanglimi劍葉中小維管束數(shù)目減少，大維管束中3個和4個特異導(dǎo)管的出現(xiàn)縮小了單個導(dǎo)管的體積，減弱了其將根部的無機鹽、水分等向劍葉輸送的能力，降低了光合作用的水分利用率，進而在一定程度上影響了光合效率。從光合特性和與其相關(guān)的細胞結(jié)構(gòu)方面對Shuanglimi的生理特性進行初步探討，可為進一步研究其子粒特性和生殖特性奠定基礎(chǔ)，也為全面了解雙子房突變體提供了有意義的參考資料。

參考文獻：

[1] 黃群策. 離子束介導(dǎo)技術(shù)在生物體遺傳改良上的發(fā)展趨勢[J]. 原子核物理評論，2007，24（1）：59-64.

[2] TIAN H G， LIU Y W， FAN D S， et al. Study on the changes of photosynthetic characters in flag leaf after full heading stage of super rice [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2008，24（10）：268-271

[3] 楊秋云，喬江方. Li-6400光合作用測定儀在水稻的應(yīng)用及常見問題分析[J]. 實驗室研究與探索，2009，28（8）：52-55

[4] 李 玲，李娘輝，蔣素梅，等.植物生理學(xué)模塊實驗指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.80-82.

[5] 李金才，董海榮，王艷哲，等.夏玉米花絲解剖結(jié)構(gòu)與受精結(jié)實能力的研究[J].玉米科學(xué)， 2003，11（1）：57-59.

[6] 鄭國昌.生物顯微技術(shù)[M].北京：人民教育出版社，1978.225-235.

[7] LIBROJO A L， KHUSH G S. Chromosomal locat ion of some mutant genes through the use of primary trisomics in rice [A]. Rice Gentics[C]. Manila， Philippines：IRRI，1986. 249-255.

[8] 邢少辰.兩份水稻特異材料的遺傳研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，1999.

[9] 文 雯，李雙成，王世全，等.一個水稻雙子房突變體的表型鑒定和遺傳分析[J].中國水稻科學(xué)，2007，21（3）：253-258.

[10] PANDIAN R T， THIYAGARAJAN K. Inheritance of floral traits in spontaneous mutant in rice（Oryza sativa L.）[J]. Curr Sci，2004，87（8）：1051-1052.