油菜秸稈纖維素降解菌的篩選及復合菌劑的降解特性

摘要：從土壤、腐爛的木樁和成品肥料中篩選高效降解油菜秸稈纖維素的菌株，并通過正交試驗對菌種進行復配組合，篩選出一組高效降解油菜秸稈的復合菌劑，其羧甲基纖維素（CMC）酶活性為12 704.3 U/g，濾紙（FP）酶活性為1 227.7 U/g，秸稈失重率為25.65%，初步鑒定該菌劑組成為地衣芽孢桿菌B4、鏈霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。采用此復合菌劑以油菜秸稈粉為降解原料進行14 d的發酵，纖維素降解率為33.10%，半纖維素降解率為23.70%，相比于不加菌劑的對照組，自制菌劑的纖維素、半纖維素降解率分別提高了24.50%和15.60%。

關鍵詞：油菜秸稈；纖維素降解菌；復合菌系；降解特性

中圖分類號：Q93-331；TQ920.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2264-04

中國油菜種植面積和產量常年居于世界首位，2009年油菜播種面積為700×104 hm2[1]，如此巨大的油菜種植面積，在菜子收獲后必將產生大量的廢棄油菜秸稈。據測定，油菜秸稈中含有豐富的氮、磷、鉀及有機質等營養成分，然而，目前油菜秸稈并沒有得到合理的利用，大量的秸稈被直接焚燒，這不僅污染了環境，同時造成了資源和能源的極大浪費[2，3]。因此，如何有效地開發利用油菜秸稈，發揮其潛在資源價值，成為當前亟待解決的問題。

油菜秸稈的主要成分是木質纖維素類物質，木質素含量為16%～21%，纖維素為38%～42%[4]，木質纖維素的高含量是阻礙其資源化利用的關鍵。提高富含纖維素的工農業廢棄物的利用率，已成為近年來研究的熱點[5]，目前對纖維素類物質的有效利用主要采取生物法，利用微生物手段使其達到資源化處理和利用[6]。而且油菜秸稈細胞壁的結晶度較高，木質素與纖維素之間鑲嵌形成穩定結構，導致其應用遠遠不如其他主要糧食作物秸稈，針對油菜秸稈的微生物處理在國內外鮮有報道[7]。為此，以降解油菜秸稈纖維素為目的，通過從土壤、腐爛的木樁和成品肥料中篩選油菜秸稈纖維素的高效降解菌株，并對菌種的復配組合以及降解特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 智能人工氣候箱，電熱恒溫水浴鍋，恒溫干燥箱，722型可見分光光度計，電熱恒溫隔水式培養箱等。

1.1.2 樣品

1）華中農業大學校內油菜種植地收集油菜秸稈及離地面深約15～20 cm處的潮濕土壤；校門口一棵腐爛的木樁上取朽木樣。樣品自然風干后磨碎，過20目篩，裝入塑料封口袋，至4 ℃冰箱中保存。

2）市售某品牌秸稈腐熟劑。

1.1.3 培養基 LB培養基；馬鈴薯蔗糖培養基；高氏一號合成培養基；剛果紅纖維素瓊脂培養基；固體產酶發酵培養基：油菜秸稈粉10 g，無機營養液25 mL，料水比1∶2.5，pH自然，分裝于250 mL三角瓶中。無機營養液：（NH4）2SO4 1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.025%。

1.2 方法

1.2.1 油菜秸稈纖維素降解菌的篩選 稱取10.0 g樣品，加入裝有90.0 mL無菌水以及玻璃珠的250 mL三角瓶中，在搖床上180 r/min 振蕩30 min，使樣品完全分散后取出，進行系列梯度稀釋，取稀釋液涂布在剛果紅纖維素粉鑒別培養基中，30 ℃恒溫培養3～4 d，選擇周圍有透明水解圈的菌株進行劃線分離，直到得到單菌落。將純化后的菌株以點種的方式接種于剛果紅纖維素平板培養基上，30 ℃恒溫培養3～4 d，每天測定纖維素降解圈直徑（H）和菌落直徑（C），并根據降解圈直徑與菌落直徑之比H/C的大小確定初篩菌株。

采用DNS法[8]測定CMC酶活性和FP酶活性，將初篩菌株接種于以油菜秸稈粉為惟一碳源的固體培養基中，發酵產酶4 d后提取粗酶液，通過酶活性比較，最終篩選出油菜秸稈纖維素降解菌株。

纖維素酶活性定義：參照國際酶學委員會規定的國際單位IU，將酶活性單位定義為：在特定條件（pH 4.8、50 ℃）下，1 mL酶液每分鐘催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量。10 g發酵曲溶于100 mL的提取液中，則：

E=（W×N×1 000）/（t×0.1V）

式中，E為酶活性，單位U/g ，W為葡萄糖量， N為酶液稀釋總倍數，t為反應時間，V為酶液體積。

1.2.2 菌株復配組合篩選

1）菌株拮抗試驗。對最終篩選出的19株纖維素降解菌作拮抗試驗。方法如下：細菌-細菌、細菌-放線菌、放線菌-放線菌，將兩種不同的菌株在LB平板上劃線但不相交；霉菌-細菌、霉菌-放線菌，先用接種針挑取少量霉菌菌絲或孢子，點種于PDA平板中央，恒溫培養1～2 d，待霉菌直徑約5 cm時，在其周圍點種細菌或放線菌；霉菌-霉菌，用接種針分別挑取兩種不同的霉菌點接于同一個PDA平板上。以上平板均靜置于30 ℃條件下恒溫培養，觀察生長過程中是否有拮抗、抑制孢子的生成、抑菌線等現象。

2）復合菌劑正交試驗。將不產生拮抗現象的15株菌株制成菌液或孢子懸液，各菌株按等體積10%的總接種量，接種于以油菜秸稈粉為惟一碳源的固體產酶培養基中，進行正交試驗。30 ℃靜置培養，4 d后測其CMC酶活性和FP酶活性及秸稈失重率，篩選較優菌株組合。

將第一次正交試驗后篩選出的7株較優組合，即B4、M1、M3、X1、X5、A3和A8進行第二次正交試驗，以期在減少微生物種類的同時，提高復合菌劑的降解效率，進一步降低復合菌劑制備成本。

3）復合菌劑的鑒定。對二次正交試驗篩選出的復合菌劑進行菌種鑒定。細菌鑒定按《伯杰氏細菌學鑒定手冊》[9]和《常見細菌系統鑒定手冊》[10]， 進行16S rRNA及形態觀察和生理生化鑒定。放線菌的鑒定主要依據《鏈霉菌鑒定手冊》[11]和《放線菌研究應用》[12]進行。真菌鑒定主要依據《真菌鑒定手冊》[13]，以菌落特征和形態特征鑒定為主。

1.2.3 復合菌劑的制備及降解特性研究

1）復合菌劑的制備。將通過初篩、復篩、拮抗試驗以及兩次正交試驗得到的最優菌株組合中的菌株分別擴大培養后與滅菌后的麩皮按1∶1的比例混勻[14]，在各菌株適宜溫度下培養至對數生長期，晾干備用。將制得單一菌劑按等質量比為1∶1∶1∶1混合均勻，即得秸稈纖維素降解復合菌劑。

2）降解特性研究。將自制復合菌劑與市售菌劑按1% 接種于裝有200 g油菜秸稈粉的敞口塑料方盒中，添加0.5% 尿素作為氮源，調節秸稈含水量至65%～70%，接種量為秸稈干重的1%。30 ℃培養兩周，每隔兩天取樣，至4 ℃冰箱保存。測定各組秸稈失重率和秸稈纖維素、半纖維素及木質素含量的變化，考查自制菌劑的降解效率。試驗一共設3個處理：不添加任何菌劑（CK1）、添加市售腐熟劑（CK2）、接種自制復合微生物菌劑（T）。每個處理設3次重復，采用Origin 8.0軟件進行數據處理。

秸稈失重率的測定：先用濾紙過濾培養物，將殘留物水洗至中性，105 ℃烘干至恒重。減量法計算，即：

秸稈失重率=（W-W1）/W×100%

式中，W為產酶發酵前秸稈的干重；W1為產酶發酵后剩余秸稈的干重。

秸稈纖維素、半纖維素、木質素的降解率的測定方法按文獻[15-17]測定。

2 結果與分析

2.1 油菜秸稈纖維素降解菌株的篩選結果

通過纖維素降解圈的測定篩選出H/C>1的纖維素降解菌株71株，其中細菌28株，放線菌25株，霉菌18株。將初篩得到的71株產纖維素酶菌株進行固態產酶發酵，測其發酵后粗酶液的CMC酶活性和FP酶活性，按酶活性大小排序篩選出纖維素酶活性較高的菌株19株。分別是細菌B3、B4、B8、B11、B15、B19、B23，放線菌A3、A6、A8、A21、A22，霉菌M1、M3、M4、M8、M11、X1和X5。

2.2 復合微生物菌劑的制備結果

2.2.1 菌株間的拮抗試驗結果 分別對復篩得到的19株菌株進行拮抗試驗，觀察生長過程中是否有拮抗、抑制孢子的生成、抑菌線等現象。結果表明，4株細菌即B8、B11、B15和B23對霉菌有拮抗作用，剩余的15株菌株之間均無拮抗現象，因此試驗選擇此15株菌株作為進一步研究對象。

2.2.2 正交試驗結果 將拮抗試驗后篩選的15株菌株以正交試驗得到所產纖維素酶活性較高的微生物組合，結果見表1。由表1可知，經過兩次正交試驗篩選得到復合菌劑的最優組合，其CMC活性為（12 704.3±1 087.1） U/g，FP為（1 227.7±45.7） U/g，微生物組成為細菌B4、霉菌M3、X1、放線菌A8。

2.2.3 菌株的鑒定 鑒定結果表明，B4為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），A8為鏈霉菌（Sterptomyces），M3為米根霉（Rhizopus oryzae），X1來自木霉屬（Trichoderma）。

2.3 復合菌劑對油菜秸稈的降解效果

2.3.1 油菜秸稈纖維素、半纖維素及木質素含量的變化 以油菜秸稈粉為降解原料進行14 d的發酵，分別對3種處理（不添加菌劑處理CK1、添加市售菌劑處理CK2、添加自制復合菌劑處理T）的秸稈纖維素、半纖維素和木質素含量進行了測定。

從圖1可以看出，CK2和T的秸稈纖維素含量在前6 d分別減少15.8%和16.5%，在14 d發酵結束時，兩組纖維素含量分別減少26.6%和33.1%。與CK1相比，二者的纖維素含量減少顯著。處理T對纖維素的降解效果好于CK2，14 d時其秸稈纖維素的降解率比CK2高6.5個百分點，可見自制復合菌劑對秸稈纖維素的降解效果具有良好的效果。原因可能是此次試驗以纖維素酶為測定指標篩選目的菌株，然后對確定的菌株進行組合制備復合菌劑，在功能菌株的篩選上注重了秸稈纖維素的降解，因而其作用效果較市售菌劑好。圖2結果表明，半纖維素含量的變化與纖維素含量的變化成正相關。CK2和T的半纖維素含量在前6 d分別減少了19.5%和16.7%，在14 d發酵結束時，其降解率分別為28.8%和23.7%，與CK1（8.1%）相比，二者的半纖維素降解率分別高20.7和15.6個百分點。自制菌劑的處理T的半纖維素降解率明顯高于CK1，且僅比市售腐熟劑的降解率低5.1個百分點，效果差別不大。說明自制菌劑對秸稈半纖維素有較好的降解作用。

圖3為發酵后秸稈木質素含量的變化。由圖3可知，木質素含量的變化與秸稈重量、纖維素和半纖維素含量的變化呈顯著的負相關。處理CK2和T在整個發酵過程中，木質素含量呈上升趨勢。在前6 d隨著秸稈重量的迅速減少、秸稈纖維素和半纖維素的較快分解，木質素含量的增加也較快，隨后緩慢增加，到發酵結束后，處理CK2和T木質素含量分別增加了5.47%和6.11%。處理CK1的木質素含量基本沒變化，只是在前6 d略有上升。說明在發酵過程中，自制復合菌劑和市售菌劑對秸稈木質素幾乎沒有降解作用，這一結果驗證了木質素的降解是秸稈木質纖維素中最困難的研究報道[18]。

2.3.2 秸稈失重率的變化 將復合菌劑以秸稈干重1%的接種量接種到油菜秸稈粉中，測定秸稈降解率，結果（圖4）表明，14 d后，不添加菌劑處理CK1、添加市售菌劑處理CK2、添加自制復合菌劑處理T的秸稈失重率分別為7.5%、33.5%、28.3%。處理T的秸稈重量在前6 d顯著減少，到第6天其秸稈失重率就達20.4%，6 d后秸稈重量降低幅度不大。處理T與CK2的秸稈重量變化規律相似，特別是在第8天到整個發酵過程結束，兩處理秸稈的失重率很小，處理T為5.4%，CK2為6.5%，并且變化趨勢基本一致。說明此次試驗自制復合菌劑與市售菌劑的作用效果差別不大，都能有效啟動并加快油菜秸稈的降解。

3 結論

通過平板篩選以及正交試驗篩選纖維素降解菌，篩選出一組高效降解油菜秸稈的復合菌劑，其CMC酶活性為12 704.3 U/g，FP酶活性達1 227.7 U/g，秸稈失重率為25.65%，初步鑒定該菌劑組成為地衣芽孢桿菌B4、鏈霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。采用此復合菌劑進行油菜秸稈降解特性研究，結果表明，發酵前6 d，自制菌劑的秸稈失重率為20.4%，纖維素、半纖維素的降解率分別為16.5%和16.7%；到第14天發酵結束時，其秸稈失重率為28.3%，纖維素和半纖維素的降解率分別為33.1%和23.7%，與市售品牌腐熟劑處理的降解效果相當，與無菌劑的對照比較，自制復合菌劑的秸稈纖維素、半纖維素降解率分別提高了24.5和15.6個百分點，秸稈失重率提高了20.8個百分點，3個處理對木質素幾乎沒有降解效果。

參考文獻：

[1] 鐘華平，岳燕珍，劉金弟，等.中國作物秸稈資源及其利用[J].資源科學，2003，25（4）：62-67.

[2] 蘭時樂，戴小陽，李立恒，等. 油菜秸稈和雞糞高溫堆肥中微生物數量變化研究[J]. 江蘇農業科學，2010（2）：365-368.

[3] 萬楚筠，黃鳳洪，劉 睿，等. 微生物預處理油菜秸稈對提高沼氣產量的影響[J]. 農業工程學報，2010，26（6）：267-271.

[4] 劉 睿.油料秸稈多菌共同發酵降解體系的建立及初步應用[D].北京：中國農業科學院，2009.

[5] 張繼泉，孫玉英，關鳳梅，等.玉米秸稈纖維素酶解條件的初步研究[J]. 糧食與飼料工業，2002（4）：21-23.

[6] 陳小華，朱洪光.農作物秸稈產沼氣研究進展與展望[J].農業工程學報，2007，23（3）：279-282.

[7] 陳麗園，夏倫志，吳 東，等.油菜秸稈分解菌的篩選與產酶特性初探[J].中國草食動物，2007，27（5）：9-12.

[8] 劉 潔，李憲臻，高培基.纖維素酶測定方法評述[J].工業微生物，1994，24（4）：27-30.

[9] 布坎南 R E，吉布斯 N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].第八版. 中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學出版社，1984.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11] 中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1975.

[12] 阮繼生，劉志恒，梁麗播，等.放線菌研究應用[M].北京：科學出版社，1990.

[13] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[14] 咸 芳.餐廚垃圾高效處理復合微生物菌劑的研究[D].長春：吉林大學，2009.

[15] 王玉萬，徐文玉.木質纖維素固體基質發酵物中半纖維素、纖維素和木素的定量測定分析程序[J].微生物學通報，1987，14（2）：82-84.

[16] 李 華，孔新剛，王 俊.秸稈飼料中纖維素、半纖維素和木質素的定量分析研究[J].新疆農業大學學報，2007，30（3）：65-68.

[17] 薛惠琴，杭怡瓊，陳 誼.稻草秸稈中木質素、纖維素測定方法的研討[J].上海畜牧獸醫通訊，2001（2）：15.

[18] 牛俊玲，崔宗均，李國學，等.高效纖維素分解菌復合系的篩選構建及其對秸稈的分解特性[J].農業環境科學學報，2005， 24（4）：795-799.