基于代謝途徑分析的多殺菌素高產菌株選育

摘要：通過對刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）多殺菌素代謝合成途徑的分析，提出了一種代謝控制育種策略和提高誘變篩選效率的方法。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株為出發菌株，選擇不同照射時間分別對其進行紫外線照射處理，然后用含有不同抗性物質的搖瓶對誘變菌進行初篩，最終篩選出了1株高產多殺菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088。該菌株同時具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性，搖瓶發酵試驗表明， 發酵7 d多殺菌素濃度可以達到1 132.60 mg/L，較出發菌株提高了85.4%，經傳代試驗證明此菌株高產遺傳特性穩定。

關鍵詞：代謝途徑；代謝控制育種；多殺菌素；菌落形態

中圖分類號：Q819； Q815 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2309-06

當前中國農藥的應用可以簡單地總結為農藥品種多、質量低、用量大、效率低、農產品中殘留量高，對環境污染嚴重[1]，因此開發高效綠色的新型農藥顯得尤為重要。多殺菌素（Spinosad）又稱刺糖菌素，是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）通過有氧發酵聚酮合成途徑合成的大環內酯類抗生素，兼有化學農藥的速效性和生物農藥的安全性，不會對環境產生污染，對魚、畜、禽安全系數高。多殺菌素作為一種綠色生物農藥，其具有殺蟲譜廣、作用方式獨特、殺蟲活性高、半衰期短、殘留低、無抗藥性、對人畜無害、環境污染少等優點[2]，是一種具有觸殺及胃毒毒性的新型微生物源殺蟲劑，于1999年獲得美國“總統綠色化學品挑戰獎”[3]，在農牧業生產中具有廣闊的應用前景，該類產品的開發也具有良好的經濟效益和社會效益。

刺糖多孢菌屬于糖多孢菌屬（Saccharopolyspora），是迄今發現的惟一可以通過好氧發酵產生多殺菌素的菌株。目前國外多殺菌素的研究領域已延伸到開發殺蟲活性更高、生物安全性更好的衍生物上。國內對發酵生產多殺菌素的研究起步晚，最近幾年也取得了很大的進展，但較國外研究水平還有很大的差距[4]。國內報道多殺菌素高產菌株較高生產水平為800～1 260 mg/L[5，6]，而國外早在10多年前就實現了工業化生產。多殺菌素的制備方法主要為微生物液體發酵合成，生物合成多殺菌素具有突出的優點，工藝條件較易控制、產品質量穩定、提取較為方便，但微生物液態發酵生產多殺菌素產量很低，主要問題是缺乏高產菌株，以致影響了該物質的應用。因此篩選高產菌株，為中國農藥領域開辟新型綠色產品，對農牧業生產具有重要的意義。試驗運用理性篩選思路和高效誘變方法，篩得高產菌株，并對其進行生物化學和遺傳學分析。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株，由天津北洋百川生物技術有限公司保藏。

1.2 培養基

保藏分離培養基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.5～6.7 ， 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子培養基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 6.5～6.7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖 40 g/L，可溶性淀粉 30 g/L，玉米浸液 15 g/L，棉子濃縮粉 20 g/L，酵母粉 20 g/L，碳酸鈣 3 g/L，pH 7.0～7.2 ， 121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 主要試劑

試驗所用主要試劑情況見表1。

1.4 菌株QYLZ 88912對所用抗性物質的耐受上限試驗

將出發菌株的孢子懸浮液涂布于含有不同抗性物質、不同設計水平的平板，每個處理做3個平行，在相對濕度70%～80%、29 ℃的培養箱中培養7～9 d，觀察抗性平板的菌株生長情況，確定出發菌株對所用抗性物質的致死（耐受）上限。

1.5 菌株的誘變處理

1.5.1 孢子懸浮液的制備 選擇生長良好的多殺菌素出發菌株QYLZ 88912斜面菌種，用無菌生理鹽水將其孢子洗下，轉入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中振蕩30 min，使孢子充分分散，用脫脂棉過濾孢子懸浮液，并調節孢子懸浮液濃度為106～107個/mL，備用。

1.5.2 致死率測定 取處理好的孢子懸浮液于30 W紫外燈下30 cm處分別照射不同的時間進行誘變處理，將誘變后的孢子懸浮液梯度稀釋涂于保藏分離培養基平板，于29 ℃避光培養7～9 d，計算致死率。

1.6 分析方法

1.6.1 色譜分析 高效液相色譜儀Agilent technologies 1200 series；色譜柱Agilent Nucleosil 100-5 C18，5 μm，150 mm×4.6 mm；流動相甲醇-乙腈-2%乙酸銨水溶液，甲醇∶乙腈∶2% 乙酸銨水溶液（體積比）為 45∶45∶10；流速1.5 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長250 nm；柱溫35 ℃；檢測器為紫外線檢測器。

1.6.2 標準曲線繪制 用色譜純甲醇溶解多殺菌素標準品，并配制成1 000 mg/L 的多殺菌素標準溶液，然后再依次稀釋成800、600、450、300、200、100 mg/L的多殺菌素標準溶液。按照1.6.1所給出的色譜條件進行HPLC檢測，每一個濃度3次重復，以多殺菌素A峰和D峰面積之和為縱坐標、多殺菌素標準溶液的濃度值為橫坐標繪制標準曲線。

1.7 多殺菌素的發酵與提取

采用500 mL三角瓶，裝液量為50 mL，29 ℃下240 r/min發酵7 d，取10 mL 新鮮的多殺菌素發酵液，加入等體積甲醇，于200 r/min下振蕩浸提2 h，15 000 r/min離心8 min，取上清液，過針孔過濾器后，用HPLC法測定上清液中多殺菌素的濃度。

1.8 統計分析

用SAS 2.0 統計分析軟件分析并對所得誘變株的產量數據進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 多殺菌素標準曲線

按照1.6.1的色譜條件和1.6.2所給出的標準溶液配制方法，用HPLC檢測不同濃度多殺菌素標準溶液的峰面積，所得多殺菌素的標準曲線見圖1。線性回歸方程為y=5.706 7x-7.082 0，R2=0.999 59，說明該方程能很好地反映多殺菌素與響應信號間的線性關系。

2.2 不同劑量紫外線照射的誘變效果

考慮到菌株對紫外線的耐受能力，研究測定了紫外線分別照射5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s時的致死率，得到了致死率曲線（圖2），由圖2可知，隨著紫外線照射時間的延長，致死率增大。在紫外線照射時間為25 s時，致死率達到95%，在紫外線照射時間為5、15 s時，致死率分別為35%和70%。對于不同的菌株，由于在不同的致死率下其正突變的概率是不容易確定的，為了增加菌株的正突變，篩選出高產菌株，研究采用的紫外線誘變劑量為5、15、25 s，將經過不同照射時間處理的孢子懸浮液混合后用于初篩。

2.3 菌株QYLZ 88912對所用抗性物質的敏感上限

將出發菌株的孢子懸浮液涂布于含有抗性物質的平板上培養7～9 d，然后觀察抗性平板上菌株生長情況，結果見表2。從表2可以看出菌株QYLZ 88912對磺胺胍的耐受上限為5 mg/L，對鼠李糖的耐受上限為 8 g/L，對丙酸鈉、鏈霉素和紅霉素的耐受上限分別為10 g/L、6 mg/L和30 mg/L。為了得到能耐受這些物質的抗性菌株，試驗選擇磺胺胍10 mg/L、鼠李糖12 g/L、丙酸鈉15 g/L、鏈霉素12 mg/L、紅霉素40 mg/L作為誘變后混合菌液的初篩濃度。

2.4 菌株的篩選策略與結果

選擇5、15、25 s照射時間分別對菌株QYLZ 88912的孢子懸浮液進行紫外線照射處理，然后把3個不同照射時間的孢子懸浮液混合均勻，進行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6 3個稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，29 ℃避光培養9～12 d。將長出的誘變菌株接種到含有10 mg/L磺胺胍的種子培養基中培養，29 ℃恒溫搖床200 r/min振蕩培養3～4 d，能夠生長的即為具有磺胺胍抗性的誘變菌。再將此種子液以10%接種量（體積分數，下同）接種到含有12 mg/L鏈霉素的種子培養基中培養，能夠生長的即為兼有磺胺胍抗性和鏈霉素抗性的誘變菌。再將本次獲得的種子液以10%接種量接種到含有40 mg/L紅霉素的種子培養基中培養，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性的誘變菌。再將此次獲得的種子液以10%接種量接種到含有12 g/L鼠李糖的種子培養基中培養，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素、紅霉素和鼠李糖抗性的誘變菌。最后再將此步獲得的種子液以10%接種量接種到含有15 g/L丙酸鈉的種子培養基中培養，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素、紅霉素、鼠李糖和丙酸鈉5種物質抗性的誘變菌。

按照上述方法，依次將篩到的抗性標記菌株菌液交叉接入含有其他抗性物質的搖瓶里，最終分別得到了SG+系列、SG+St+系列、SG+St+Er+系列、SG+Rh+St+Er+系列的抗性標記菌株種子液。將每步得到的不同抗性標記菌株的種子液都做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6 3個稀釋度的孢子懸浮液涂布保藏分離培養基平板，29 ℃培養9～12 d，挑選具有特殊形態的菌落。最終共挑出452株誘變菌株，平板劃線分離后，每株保藏3支斜面，按1.7的方法進行搖瓶復篩。選取其中有代表性的16株菌，其菌落形態和產量見表3。最終篩出了1株具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素3種抗性的正突變菌株SG+St+Er+-088，多殺菌素產量為1 132.60 mg/L，SD為40.34，穩定性良好。比出發菌株QYLZ 88912的產量提高了85.4%。

在進行大批量的挑菌篩菌過程中，出現各種形態的菌落（圖3），后續試驗發現梅花狀、正面白色、表面干燥、孢子豐滿、質地較為均勻的菌株正突變的概率較大；表面褶皺、乳頭狀、邊緣不規則、中部凹陷、孢子不豐滿、奇形怪狀的菌落負突變的概率較大。依據菌落形態特征來挑選那些正突變概率較大的菌株，之后再用于搖床復篩，這樣可以提高篩菌效率，有效篩得高產菌。

借助菌落形態進行誘變初篩可以提高篩選效率，尤其是對于放線菌這類生長周期較長的菌株。但是這種方法對無菌培養和無菌操作過程要求比較嚴格，如果其中的一個環節染菌，就會導致整個抗性菌株篩選過程受到影響。

2.5 SG+St+Er+-088的遺傳穩定性分析

將高產菌株SG+St+Er+-088在保藏分離培養基上連續傳代6次，其產孢速度基本一致；將各代菌株接入種子培養基，其進入對數生長期的時間和最高生物量基本一致；多殺菌素產量穩定在1 080.87～1 191.12 mg/L（表4），表明該菌株遺傳特性穩定。

2.6 統計分析結果

用SAS 2.0軟件對所得誘變株的產量進行差異顯著性檢驗（出發菌株產量為610.75 mg/L），結果見表5。由表5可知，誘變菌株SG+St+Er+-088和出發菌株QYLZ 88912之間存在顯著性差異；誘變菌株產量為1 132.60 mg/L，相對于出發菌株，產量提高85.4%，可以確定所篩出的誘變菌株SG+St+Er+-088為多殺菌素高產菌株。

3 小結與討論

3.1 代謝控制育種思路

3.1.1 紅霉素抗性菌株的選育 大環內酯類抗生素的誘導抗性在許多鏈霉菌菌株中存在，此類抗生素作用于放線菌的核糖核蛋白體，抑制肽酰基合成和轉移。紅霉素能與50S大亞基結合，并阻斷移位作用，將肽酰-tRNA“凍結”在A位點上[7，8]。誘導后的表型是23S核糖體RNA腺嘌呤中的N6-甲基化，使核糖體對所有的大環內酯類抗生素都呈抗性，此時大環內酯類抗生素便開始合成[9]。

紅霉素與多殺菌素同屬大環內酯類抗生素，紅霉素抗性突變株可能部分解除終產物代謝調控作用，從而使多殺菌素的生物合成提前。本研究利用紅霉素對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選以解除終產物代謝調控作用。

3.1.2 鼠李糖抗性菌株的選育 鼠李糖在刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的過程中，不僅是細胞壁的重要組成成分，也是多殺菌素合成過程中的一個重要的中間產物，其連接到糖苷配基上是糖苷配基轉換為多殺菌素的第一步，所以鼠李糖既是初級代謝的終產物，又是次級代謝產物多殺菌素合成的前體。因此，在多殺菌素發酵過程中需要大量的鼠李糖，如果其供應不足，就會影響細胞生長和產物合成[10]，而如果鼠李糖積累過多，受到反饋抑制，也會影響多殺菌素的合成，所以必須去除鼠李糖的反饋調節。本研究利用鼠李糖對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，盡可能改變原始菌株的代謝調控機制，增加鼠李糖的積累量，滿足細胞生長和產物合成的需要，提高多殺菌素的產量。

3.1.3 丙酸鈉抗性菌株的選育 多殺菌素在結構上是聚酮類物質，多殺菌素聚酮體的形式是以丙酸為起始單位，按A-A-P-A-A-A-A-A-A-A（A-乙酰，P-丙酰）的順序添加10個酰基縮合而成的，所以丙酸是多殺菌素合成的一個重要的前體。添加外源性前體物質有利于次級代謝物的合成，但過量的前體物質對菌體有毒害和抑制作用[11，12]。本研究利用丙酸鈉對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，以期獲得對前體耐受性高的多殺菌素突變菌株。

3.1.4 磺胺胍抗性菌株的選育 磺胺胍可以弱化能量代謝途徑，篩選具有磺胺胍抗性的菌株，可以強化代謝流，增加多殺菌素的合成代謝能力，同時能增加菌株生長活力，在培養過程中，減少雜菌污染的幾率。

3.1.5 鏈霉素抗性菌株的選育 在抗生素生物合成調控機理的研究中發現，特異性調節基因和其他調節基因的過量表達，都可以誘導抗生素的過量合成。對于核糖體結構的修飾和改造主要分為對翻譯元件的修飾改造和對轉錄元件的修飾改造兩方面的內容。鏈霉素抗性（Str）突變屬于對翻譯元件的修飾改造[13]。四磷酸鳥苷酸（ppGpp）在細胞形態分化（如氣生菌絲和孢子的形成）和啟動次級代謝產物（如抗生素、色素和酶等）的生物合成中起著很重要的作用，它的合成基因是relA。當微生物菌株的relA基因發生突變時，微生物便不能合成ppGpp，其次級代謝產物也不能生產。但是如果在該relA突變菌株中引入rpsL基因（編碼核糖體蛋白 S12），會發現在ppGpp合成能力沒有恢復的情況下就能讓其恢復產次級代謝產物的能力[14]，從而增加刺糖多孢菌的產抗生素水平。試驗利用鏈霉素對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，激活其產生抗生素的潛能。

3.2 結論

試驗將代謝控制育種的思路與高效篩選策略應用于多殺菌素高產菌株的初篩，在試驗過程中，選擇不同照射時間對出發菌株進行紫外線照射處理，將得到的孢子懸浮液混合之后，運用含有不同抗性物質的搖瓶對誘變菌進行連續的篩選，篩到了具有不同抗性物質標記的菌株，得到1株高產多殺菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088，該菌株同時具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性，搖瓶發酵表明，發酵7 d多殺菌素濃度可達到1 132.60 mg/L，較出發菌株提高了85.4%，經傳代試驗表明此菌株的高產遺傳特性穩定。

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