大葉胡頹子莖抗菌活性部位研究

摘要：大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla Thunb）莖經乙醇提取、系統溶劑萃取分離得到5個部位。用濾紙片法檢測各部位對5種常見呼吸道致病菌的抗菌活性，著重研究乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗菌作用。結果表明， 大葉胡頹子莖正丁醇部位和乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii）均有較強的體外抑制作用，兩個部位對不同菌種的抑菌效果有差異，正丁醇部位的綜合抑菌效果好于乙酸乙酯部位。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位和正丁醇部位對常見的5種呼吸道致病菌有較強的體外抗菌作用，說明其含有抗菌成分，可以用于研制治療呼吸道疾病的抗菌消炎新藥物。

關鍵詞：大葉胡頹子莖；溶劑萃取；乙酸乙酯部位；正丁醇部位；抑菌作用

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2315-03

大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla Thunb）又名圓葉胡頹子、冬棗、海棗，屬胡頹子科（Elaeagnaceae）胡頹子屬（Elaeagnus）植物，為高2～3 m的常綠灌木，葉片正面翠綠，背面為銀白色，果實紅色可食。在中國主要分布于山東、浙江、江蘇的沿海島嶼和臺灣，在日本、韓國等國家也有分布。它根系發達，耐鹽堿，耐干旱、瘠薄，抗海風、海霧，是沿海防風和海濱綠化的良好樹種。大葉胡頹子根、葉、果皆可入藥，民間多用于平喘、止咳，也用來治吐血不止[1]。將大葉胡頹子作為藥材栽培，并以其果實代替丹皮，可用以治療婦科疾病[2，3]，近年的研究發現大葉胡頹子莖、葉對常見的呼吸道致病菌具有抗菌活性[4，5]，在藥品開發方面展現出利用前景。胡頹子科植物有3屬80余種，許多是具有很高生態和經濟價值的植物[6]。目前國內外對該科植物的研究方向主要是成分分析、食用、藥用、環境保護，國外研究還涉及能源資源、共生根瘤菌和分子生物學方面[7-9]。試驗考察大葉胡頹子莖不同部位對5種呼吸道病菌的抗菌活性，為進一步追蹤其化學成分提供依據和導向，為海濱鹽生植物大葉胡頹子的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物與菌種 大葉胡頹子莖，采于山東威海榮城的雞鳴島。金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii）由中國農業大學煙臺研究院實驗室與中國科學院煙臺海岸帶研究所提供。

1.1.2 試劑與儀器 95%乙醇、70%乙醇、石油醚（沸程30～60 ℃），市售；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鈉均為市售分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為市售生化試劑；純凈水為實驗室自制。牛肉膏蛋白胨培養基（用于細菌培養）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15～20 g、蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。QE-200 g型粉碎機（武義縣屹立工具有限公司）；FA1104N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（嘉興市中新醫療儀器設備有限公司）；PS-5000型超聲波清洗機、CN61M/H-1650型臺式高速離心機（北京中西泰安技術服務有限公司）；AB204型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；減壓抽濾裝置、LRH-250-A型智能生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；SW-CJ型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大葉胡頹子莖不同部位的制備 大葉胡頹子莖38 ℃烘干后用粉碎機打成粉末，用95%的乙醇回流提取3 h，倒出上清液，濾渣再用95%乙醇回流提取3 h，按上述方法再用70%的乙醇回流提取2次，合并4次的濾液用高速離心機3 000 r/min離心15 min，抽濾上清液減壓濃縮至無醇味，加純凈水使其完全溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液及水相減壓濃縮成浸膏。

1.2.2 菌懸液的制備 用接種環挑取已活化的細菌置于無菌生理鹽水試管中，充分混合，為初始菌懸液；配制系列濃度的菌懸液，并做好標記。用平板計數法確定各菌懸液細菌濃度，取濃度為1.0×105～1.0×106 CFU/mL的菌懸液為試驗液。

1.2.3 抑菌試驗 采用濾紙片法[10]。將各溶劑萃取物的浸膏分別用純凈水配制成30 mg/mL藥液，經0.22 μm濾菌膜過濾。在超凈工作臺內將滅菌濾紙片用無菌鑷子攤布于裝有藥液的滅菌培養皿中吸收藥液，浸泡15 min，不斷翻動，使濾紙片吸足藥液。取出含藥液濾紙片自然瀝干后放入無菌培養皿內保存。將滅菌后的培養基傾入無菌培養皿中，待其凝固后移取0.1 mL菌懸液于培養皿中，用無菌涂布棒將菌懸液均勻涂布，制成含菌平板，以涂布純凈水的平板作對照。用無菌鑷子將含藥液濾紙片均勻間隔貼于平板上，每皿放4片，以純凈水作為對照。放入37 ℃生化培養箱中培養24 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值并作方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對供試菌的抑菌效果

試驗發現氯仿部位和水部位均未表現出抑菌效果，石油醚部位的得率很小且抑菌效果很弱，后續不作重點研究。中等極性的乙酸乙酯部位和較強極性的正丁醇部位表現出明顯的抑菌作用，是大葉胡頹子莖的抗菌活性部位，將其作為研究對象。

大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌和大腸桿菌都具有抑菌作用，對試驗數據進行方差分析（表1）和多重比較（表2）可知，大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對5種供試菌抑菌作用存在極顯著性差異。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的抑制作用與對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用有極顯著差異，對鮑曼不動桿菌的抑制作用與對金黃色葡萄球菌的抑制作用差異不顯著，對銅綠假單胞菌的抑制作用與對大腸桿菌的抑制作用差異不顯著。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對供試菌抑制作用順序為：金黃色葡萄球菌>鮑曼不動桿菌>肺炎克氏桿菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌。

2.2 大葉胡頹子莖正丁醇部位對供試菌的抑菌效果

大葉胡頹子莖正丁醇部位對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌和大腸桿菌都具有抑菌作用，且對5種供試菌的抑制作用存在極顯著性差異。對試驗數據進行方差分析（表3）和多重比較（表4）可知，大葉胡頹子莖正丁醇部位對鮑曼不動桿菌的抑制作用與對其他菌種的抑制作用有極顯著差異；對銅綠假單胞菌的抑制作用與對金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌、大腸桿菌的抑制作用有極顯著差異。對金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌、大腸桿菌的抑制作用差異不顯著。大葉胡頹子莖正丁醇部位對供試菌抑制作用依次為：鮑曼不動桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌≈肺炎克氏桿菌≈大腸桿菌。

2.3 大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位抑菌效果的比較

大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位抑菌效果比較的情況見表5。由表5可見大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對5種供試菌抑菌作用的大小排序與正丁醇部位不同，乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，而正丁醇部位對鮑曼不動桿菌的抑菌圈直徑最大。正丁醇部位對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用極顯著強于乙酸乙酯部位；對金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著弱于乙酸乙酯部位，對肺炎克氏桿菌和大腸桿菌的抑制作用與乙酸乙酯部位沒有顯著差異。綜合看來，正丁醇部位的抑菌效果強于乙酸乙酯部位。

3 小結與討論

1）大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位對5種常見的呼吸道致病菌皆有較強的抑菌作用，表明其抗菌譜較廣。正丁醇部位的綜合抑菌效果強于乙酸乙酯部位，且兩個部位對不同菌種的抑菌效果不同，說明兩者的抑菌成分不同，具有進一步研究的意義。

2）試驗明確了大葉胡頹子莖正丁醇部位和乙酸乙酯部位為抑菌的活性部位，為尋找大葉胡頹子莖中的抑菌活性成分奠定了基礎，同時也進一步闡明了大葉胡頹子的藥用價值。大葉胡頹子在食用及觀賞等方面均值得深入研究。

3）分離純化大葉胡頹子莖中的活性成分，明確其分子結構，將進一步促進其醫藥價值的利用。

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