一株類胡蘿卜素高產菌的篩選與鑒定

摘要：以自然環境中松樹林土壤、下水道淤泥、飯店周圍油膩土壤、農田土壤、落花、十字花科蔬菜、辣椒以及實驗室空氣為類胡蘿卜素產生菌的初分離材料，采用酸-熱破壁法用丙酮提取類胡蘿卜素，根據單位體積發酵液類胡蘿卜素產量確定了一株高產光合細菌（BSⅡ6）。進一步對其形態、生理生化特征、類胡蘿卜素產量、分子生物學特征進行了初步研究，初步鑒定菌株BSⅡ6為無色桿菌屬的一個種Achromobacter sp.，BSⅡ6所產色素主要成分為番茄紅素，類胡蘿卜素產量達到了7.46 μg/mL。

關鍵詞：類胡蘿卜素；菌種；篩選；鑒定；發酵；無色桿菌屬（Achromobacter）

中圖分類號：Q93-331 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2389-04

類胡蘿卜素（Carotenoids）是自然界中廣泛存在的色素，是萜烯基團類的不飽和化合物，結構中有許多共軛雙鍵。由于它是維生素A前體，同時又具有抗氧化、預防和抑制腫瘤、增加宿主免疫力等功能，已被廣泛應用于食品、飼料、化妝品、醫藥工業。目前，主要是通過化學合成法、植物提取法獲得類胡蘿卜素，少數是由微生物發酵生產。化學合成色素由于毒性問題而受到限制，從植物中提取類胡蘿卜素難以大量生產，且成本較高。因此，利用微生物發酵獲取類胡蘿卜素是較好的方式。目前，國內外利用微生物合成類胡蘿卜素的研究主要集中在三孢布拉霉菌和紅酵母方面。其中，三孢布拉霉菌菌株生長迅速、生物量高，是國際上采用的實現工業化生產的優良菌株。前蘇聯和東歐地區已達小規模工業生產水平，但技術工藝較為復雜。在我國，該方法正處于研究階段。自21世紀90年代初以來，我國對此方法進行了大量研究，但發酵過程中存在一系列復雜的技術性問題，如發酵液黏稠度高、溶解氧利用難等，從而距大規模工業化生產還有相當的一段距離。利用光合細菌生產類胡蘿卜素，雖然目前色素發酵水平比三孢布拉霉菌低，但也具有一定的優點：可以利用蔗糖、廢糖蜜等進行培養，成本較低廉；周期短，發酵控制容易，有利于工業化生產。因此，無論是從品質技術、資源還是成本等因素考慮，研究光合細菌生產類胡蘿卜素都具有一定的應用價值和開發前景。本研究從各種自然環境中分離篩選產類胡蘿卜素菌株，根據單位體積發酵液類胡蘿卜素產量確定了一株高產光合細菌（BSⅡ6），并對其形態、生理生化特征、類胡蘿卜素產量、分子生物學特征進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 土樣：采集了農田土壤、下水道淤泥、松樹林土壤、飯店周圍油膩土壤4種土樣。落花：收集了櫻花、油菜花、白菜花、迎春花、蘿卜花、豌豆花、鳶尾花、不知名野花8種植物的花。蔬菜：十字花科蔬菜、辣椒等采集于貴陽市花溪區農家菜園。還有實驗室空氣。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基配方為牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.0～7.2，于121 ℃滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基配方為馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 自然；配制方法為馬鈴薯去皮切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖及瓊脂，溶化后補足水至1 000 mL，于121 ℃滅菌30 min。種子培養基配方為葡萄糖5 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，于115 ℃滅菌20 min。發酵培養基[2]配方為葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，Na2HPO4 1 g/L，KH2HPO4 1 g/L，pH 6.0（真菌）、7.2～7.4（細菌），于121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選

1）土樣菌株的分離。采用稀釋平板法。先用研缽將混勻的土樣磨碎，稱取新鮮土壤10 g，放入盛有100 mL無菌水的250 mL三角瓶內（三角瓶內有玻璃珠），然后放在搖床上以70 r/min振蕩10 min，靜置片刻，取10-4、10-5、10-6 3個稀釋度，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培養48 h，挑出呈黃色、紅色、橙黃色的菌落進一步純化，獲得純培養，并接種于斜面培養基保存。

2）落花菌株的分離。將落花用水沖干凈，用70%乙醇浸泡5 min，在牛肉膏蛋白胨平板上涂抹接種，后續操作與土樣菌株的分離相同。

3）蔬菜內生菌的分離。①內生細菌的分離：將植株用水沖洗干凈，然后隨機稱取根、莖、葉各器官0.5 g，用70%乙醇浸泡5 min，再用1 g/L HgCl2表面消毒5～10 min（葉片5 min，根、莖10 min），用無菌水沖洗3次，樣品晾干后轉入無菌研缽中研磨勻漿。加10 mL無菌水碾碎，靜置15 min后，配置成10-2、10-3、10-4 3個稀釋度，各取100 μL涂牛肉膏蛋白胨平板，各處理重復3次，于32 ℃黑暗培養48～72 h，后續操作與土樣菌株的分離相同。②內生真菌的分離：采用組織塊法分離內生真菌。將植株不同器官的樣品用去離子水沖洗干凈，浸泡于75%乙醇2～5 min進行表面消毒，再將樣品放入1 g/L HgCl2溶液中進一步消毒10～30 s，最后用無菌水沖洗3次。在無菌條件下將樣品切成小片，其中葉片切成1 cm×1 cm的小塊，根、莖與枝取韌皮部切成0.5 cm×0.5 cm左右的小段，再移入加有鏈霉素和青霉素的PDA平板中，于28 ℃避光培養3～7 d，待長出菌體，后續操作與土樣菌株的分離相同。

4）培養條件。斜面培養：細菌接種牛肉膏蛋白胨斜面，于32 ℃培養24～48 h。真菌接種PDA斜面，于28 ℃培養48～120 h。搖瓶培養：將斜面培養的菌體制備成菌懸液，接種于細菌和真菌發酵培養基，真菌于28 ℃以150 r/min培養120 h；細菌于32 ℃以150 r/min培養120 h。

1.2.2 細胞破碎方法 酸-熱破壁法：取搖瓶培養的菌液5 mL加入潔凈離心管中，以4 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入3 mol/L HCl 5 mL，于室溫振蕩浸泡30 min，沸水浴加熱4 min，冰水浴冷卻，以4 000 r/min離心15 min，棄上清，細胞泥用去離子水洗滌2次后加入5 mL丙酮，于室溫振蕩30 min，離心所得上清即類胡蘿卜素提取液。

1.2.3 篩選方法 初篩方法采用顯色反應法[3]。加等體積石油醚于類胡蘿卜素丙酮浸提液，振蕩，靜置分層，取上層醚層加入等體積的含100 g/L KOH的甲醇溶液，充分振蕩，加入少許50 g/L NaCl溶液。取上層黃紅色醚層，分別傾入裝有2 mL濃H2SO4、濃HCl的試管中，觀察顏色變化。

復篩方法采用三指特征吸收峰法。將從發酵液經離心、破壁、有機溶劑浸提后的色素在TU-1901雙光束紫外可見分光光度計上進行全波長掃描。

1.2.4 類胡蘿卜素的測定 取干菌體1 g，或5 mL發酵液以4 000 r/min離心、水洗兩次得到的濕菌體，加5 mL 3 mol/L HCl振蕩30 min；沸水浴4 min，速冷，以4 000 r/min離心15 min，去HCl，用去離子水洗兩次，去上清液，加5 mL丙酮，振蕩30 min；以4 000 r/min離心15 min，取色素上清液，用丙酮作對照，用722分光光度計在474 nm處測吸光度[5]。色素含量（μg/g）=A474 nm×V×D/（0.16×W）；色素產量（μg/mL）=A474 nm×V×D/（0.16×L）。式中，A474 nm表示最大吸光度；V表示提取色素所用溶劑量（mL）；D表示測樣時所稀釋的倍數；0.16是類胡蘿卜素消光系數；W表示菌體干重（g）；L表示發酵液體積（mL）。

1.2.5 菌種的鑒定 形態與生理生化鑒定：根據菌株生長的形狀、顏色、大小、透明度以及生理生化特征查閱《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）[6]。分子生物學鑒定：利用16 S rDNA序列對細菌菌株進行分子生物學鑒定。細菌基因組DNA的提取按照試劑盒MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0的操作步驟。引物F：5′-GAGAGTTTGATCC

TGGCTCAG-3′，R：5′-GCCCCCGTCAATTCCTTTGA

G-3′；以基因組DNA為模板進行PCR擴增。反應體系為50 μL：ddH2O 19 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，混和引物2 μL，DNA模板4 μL。擴增程序：94 ℃，5 min；94 ℃、50 s ，54 ℃、40 s，72 ℃、40 s，40個循環；72 ℃，8 min。采用標記終止物法進行序列測定。運用Blastn 2.2.2程序搜索核酸數據庫并進行分析。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

從土壤、落花、各種蔬菜以及實驗室空氣中分離到呈紅色、黃色、橙紅色的菌株共505株。分別將這些菌株進行搖瓶培養，提取菌體色素，然后采用濃H2SO4、濃HCl顯色反應初篩到能產類胡蘿卜素的菌株25株，其中真菌18株、細菌7株。25株菌株所產色素呈現出紅色、黃色、淺黃色和橙紅色（表1）。

2.2 復篩結果

由于類胡蘿卜素分子多為萜類物質，它們是由多個異戊單體聚合而成，所以在波長300～600 nm處有典型的三指特征吸收峰。將初篩得到的25株菌株發酵菌體的色素粗提液進行波譜掃描，結果均有三指特征吸收峰（波譜掃描圖略），各菌株最大吸收峰波長及兩側肩峰波長不完全相同，表明篩選到的菌株所合成的類胡蘿卜素種類不同。其中1株分離自下水道的細菌菌株BSⅡ6的類胡蘿卜素產量顯著高于其他菌株，達到了7.46 μg/mL（表1）。其300～550 nm波長掃描光譜分析的最大吸收峰為474 nm，在其兩側455 nm和501 nm波長有兩個明顯的肩峰（圖1），這是類胡蘿卜素具有的特征性吸收曲線[7]。參照文獻[8]分析最大吸收波長可知，BSⅡ6所產類胡蘿卜素的主要成分可能是番茄紅素。

2.3 菌株BSⅡ6的鑒定結果

2.3.1 形態特征 由圖2可知，菌株BSⅡ6在牛肉膏蛋白胨培養基上生長，菌落圓形、橙紅色、不透明、表面平滑無皺褶、邊緣整齊。在肉湯培養基內不形成菌膜，細胞呈絮狀沉淀聚集在試管底部。由圖3可知，菌株BSⅡ6為革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，端圓，無芽孢，細胞長度為1.8～2.3 μm，寬度為0.3～0.4 μm。

2.3.2 菌株BSⅡ6的生理生化特征 菌株BSⅡ6的生理生化特征見表2，結合形態特征，根據《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）初步鑒定菌株BSⅡ6為無色桿菌屬。

2.3.3 菌株BSⅡ6的分子生物學鑒定 從菌株BSⅡ6基因組擴增獲971 bp的16 S rDNA序列片段，經BLAST核酸數據庫搜索、分析發現，與數據庫中已知的序列相似性最高的是菌株Achromobacter xylosoxidans A8（木糖氧化無色桿菌）16 S rDNA序列，其相似性為92%，相似性片段長度為893 bp。結合形態與生理生化特征，將菌株BSⅡ6鑒定為無色桿菌屬的一個種Achromobacter sp.。

3 小結與討論

從土樣、落花、蔬菜還有實驗室空氣中共分離篩選出了能產類胡蘿卜素的18株真菌、7株細菌。其中一大部分菌株都是從蘿卜類、白菜類、甘藍類十字花科植物中分離獲得，說明十字花科植物是分離產類胡蘿卜素微生物的良好資源。

分離的BSⅡ6菌株的類胡蘿卜素產量最高，達到了7.46 μg/mL，所產色素主要成分為番茄紅素。BSⅡ6菌株經形態學、生理生化以及分子生物學方法聯合鑒定為無色桿菌屬的一個種Achromobacter sp.。

參考文獻：

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[7] 李福枝，劉 飛，鄧 靖.沼澤紅假單胞菌中類胡蘿卜素的提取與分析[D].長沙：湖南工業大學，2006.

[8] 韓 波.光合細菌產類胡蘿卜素的研究[D].濟南：山東大學，2006.