金絲草總黃酮大孔樹脂純化工藝優(yōu)化

摘要：比較了5種大孔樹脂對金絲草（Pogonatherum crinitum）中總黃酮的吸附及解吸性能，采用靜態(tài)和動態(tài)的吸附-解吸試驗，利用紫外可見分光光度計測量金絲草總黃酮的濃度，研究不同的工藝條件對總黃酮純化的影響。結(jié)果表明，靜態(tài)分離純化工藝的最佳參數(shù)為DA-201大孔樹脂質(zhì)量與吸附液體積的比值1∶10（m/V，g∶mL）、吸附液pH 3.00、恒溫振蕩時間3 h、解吸液為70%的乙醇溶液。動態(tài)分離純化工藝的最佳參數(shù)為采用2 mL/min流速上樣，用3個柱體積的70%乙醇，以2 mL/min流速洗脫可較好地分離純化金絲草總黃酮。

關(guān)鍵詞：金絲草（Pogonatherum crinitum）；總黃酮；純化；DA-201大孔樹脂

中圖分類號：TS201.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2393-04

金絲草（Pogonatherum crinitum）又名落蘇、貓尾草、貓毛草等，為禾本科金絲草屬植物金絲草的干燥全草。文獻記載金絲草性寒，無毒，具有清熱、解暑、利尿之功效[1]。金絲草資源十分豐富，含有多種活性成分，其中主要的活性成分為黃酮類化合物[2，3]，而黃酮類化合物具有多種生物活性。近年來掀起了黃酮類化合物研究、開發(fā)利用的熱潮，促使其在化妝品、醫(yī)藥、食品等工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用[4]。因此將金絲草總黃酮高效、快速地提取分離出來，并通過純化得到一定純度的產(chǎn)品，具有很高的經(jīng)濟價值與現(xiàn)實意義。且目前對金絲草總黃酮的研究甚少，尚未發(fā)現(xiàn)有對其進行純化工藝的研究報道。本研究采用大孔樹脂分離純化金絲草總黃酮，對5種大孔樹脂進行了篩選，并研究金絲草總黃酮的分離純化工藝，為金絲草的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 金絲草購于潮州市南橋市場，洗凈，自然晾干，于60 ℃烘干，研碎過40目篩，備用；所有試劑均為分析純；FL-1、FL-2、FL-3、AB-8大孔樹脂購于天津歐瑞生物科技有限公司；DA-201大孔樹脂購于西安樸天吸附材料有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 752S型紫外可見分光光度計購于上海棱光技術(shù)有限公司，BT-100B型數(shù)顯恒流泵購于上海瀘西分析儀器廠，ET-Q型氣浴恒溫振蕩器購于常州榮冠實驗分析儀器廠等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻[5]中的方法，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁標(biāo)液濃度（C）與吸光度（A）標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程式為：A= 9.031 8C-0.004 0，r=0.998 9。

1.2.2 金絲草總黃酮提取液的制備及濃度測定 準(zhǔn)確稱取已烘干粉碎的金絲草樣品5.0 g，加入100 mL石油醚回流除去色素后烘干，并用100 mL 60%的乙醇浸泡過夜，然后用超聲波輔助提取兩次，減壓抽濾得到萃取液并定容至250 mL備用。按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定總黃酮濃度。

1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 將5種大孔樹脂用80%的乙醇浸泡過夜，洗滌至洗滌液無乳白色，再用去離子水洗去乙醇至洗滌液無醇味，備用[6]。

1.2.4 大孔樹脂的篩選 精確稱取經(jīng)預(yù)處理過的5種干樹脂各1.0 g，分別裝入50 mL錐形瓶中，各加入總黃酮濃度為0.780 6 mg/mL的樣品溶液10 mL。由于黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因而要達到較好的吸附效果，必須在弱酸性條件下吸附[7]，試驗吸附液pH控制在4～6之間。用恒溫振蕩培養(yǎng)箱以120 r/min于25 ℃振搖12 h，使其達到飽和吸附，抽濾，取吸附液1.0 mL于10 mL比色管中，按1.2.1測量方法操作，測定吸附液中總黃酮的剩余濃度（mg/mL）[8]，按下式計算樹脂吸附率：吸附率=[（初始濃度-剩余濃度）/初始濃度]×100%。

濾出經(jīng)靜態(tài)飽和吸附后的樹脂，用濾紙吸干表面水分，精密加入95%乙醇10 mL，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱以120 r/min在25 ℃振搖12 h，抽濾，取解吸液1.0 mL，按1.2.1測量方法操作，測定解吸液中總黃酮的濃度（mg/mL），按下式計算解吸率：解吸率=[（解吸液濃度×解吸液體積）/[（初始濃度-剩余濃度）×吸附液體積]]×100%。

1.2.5 樹脂靜態(tài)分離純化參數(shù)的優(yōu)化

1）樹脂質(zhì)量與吸附液體積的比值對吸附率的影響。準(zhǔn)確稱取篩選好的樹脂0.50、0.67、1.00和2.00 g，分別加入20.00 mL 0.771 7 mg/mL的金絲草總黃酮提取液（即吸附液），置于氣浴恒溫振蕩器上不斷振搖12 h，并分別測定吸附飽和后提取液的總黃酮濃度，計算吸附率。以樹脂質(zhì)量（g）與吸附液體積（mL）的比值為橫坐標(biāo)、吸附率（%）為縱坐標(biāo)，繪制曲線[9]。

2）乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響。選用40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液為解吸劑對吸附飽和的樹脂進行解吸，測定解吸液中總黃酮濃度，計算解吸率，繪制曲線[9]。

3）pH對吸附率的影響。用酸度計測得金絲草總黃酮提取液的pH約5.2。分別用HCl和5 g/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00，靜置備用。準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的DA-201大孔樹脂1.0 g于50 mL錐形瓶中，分別加入不同pH的金絲草總黃酮提取液各10.0 mL，置于氣浴恒溫振蕩器上，以120 r/min于25 ℃振搖12 h，并分別測定吸附飽和后提取液的總黃酮濃度，計算吸附率。以pH為橫坐標(biāo)、吸附率（%）為縱坐標(biāo)，繪制曲線[9]。

4）作用時間對吸附率的影響。準(zhǔn)確稱取處理好的DA-201大孔樹脂2.0 g于50 mL錐形瓶中，加入20.0 mL金絲草總黃酮提取液，置于氣浴恒溫振蕩器上，以120 r/min于25 ℃振搖，在24 h內(nèi)每小時吸取1 mL測定總黃酮濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)特征曲線[6]。

1.2.6 樹脂動態(tài)分離純化參數(shù)的優(yōu)化

1）吸附流速的確定。將濃度為1.203 5 mg/mL的樣品液300 mL通過3根層析柱（一個柱體積為25 mL），分別以1、2和3 mL/min的流速在同一試驗條件下進行動態(tài)吸附考察，收集流分，取各種溶液1.0 mL，分別測定吸光度，計算吸附率，確定吸附流速[6，8]。

2）吸附液體積的確定。將濃度為1.203 5 mg/mL的樣品溶液通過層析柱（一個柱體積為25 mL），按上述所確定的最佳吸附流速進行動態(tài)吸附，分段收集吸附液。每5.0 mL為1份，共收集20份。取各種吸附液1.0 mL，分別測定吸光度，計算吸附率，以吸附率（%）為縱坐標(biāo)，吸附液體積（mL）為橫坐標(biāo)，繪制吸附曲線[6，8]。

3）洗脫流度的確定。將濃度為1.203 5 mg/mL的樣品溶液50 mL通過3根層析柱（一個柱體積為25 mL），按上述所確定的吸附條件進行吸附。吸附飽和濕法裝柱后用50 mL 70%乙醇分別以1、2和3 mL/min的速度進行洗脫。取各種溶液1.0 mL，分別測定吸光度，計算洗脫液濃度，綜合考慮總黃酮解吸率及工作效率，確定最佳洗脫流速[6，8]。

4）洗脫液體積的確定。將濃度為1.203 5 mg/mL的樣品溶液通過樹脂柱（一個柱體積為25 mL），按上述所確定的吸附條件進行動態(tài)吸附，吸附飽和后水洗，至洗滌液為無色為止，濕法裝柱，分別用不同體積的70%乙醇，按確定的最佳洗脫流速進行洗脫，分段收集洗脫液。每5.0 mL為1份，共收集20份。取各種洗脫液0.5 mL，分別測定吸光度，計算洗脫液濃度，以洗脫液濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，洗脫液體積（mL）為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線[6，8]，確定洗脫液體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選結(jié)果

在相同試驗條件下進行靜態(tài)吸附與解吸，其中解吸劑采用95%的乙醇溶液，靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果見表1。一般來說，樹脂的極性與被吸附分子的極性相同或相近時吸附效果更好；樹脂有較大比表面積時吸附量更大，因此篩選樹脂時要綜合考慮樹脂的極性、比表面積等因素。多數(shù)黃酮類化合物分子極性不太高，在弱極性或非極性樹脂上會有更好的吸附效果[8]。由表1可知，F(xiàn)L-1吸附總黃酮的能力強，但解吸率比較低；FL-3的總黃酮得率處于中等水平。綜合考慮各樹脂的吸附與解吸性能，DA-201大孔樹脂吸附與解吸效果更好，故本試驗擬定選用DA-201大孔樹脂來分離純化金絲草總黃酮。

2.2 靜態(tài)純化分離參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 樹脂質(zhì)量與吸附液體積的比值對吸附率的影響 對于一定量的吸附質(zhì)而言，吸附劑用量增大，意味著吸附比表面積增大，吸附質(zhì)在吸附劑上的分布較松散，從而吸附劑對吸附質(zhì)的物理作用和化學(xué)作用加強，吸附量增加。但從經(jīng)濟角度講，吸附劑用量過多，會導(dǎo)致成本增加、吸附選擇性差等[9]。由圖1A可知，樹脂質(zhì)量與吸附液體積的比值為1∶10時，即可達到較好的吸附效果。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響 由圖1B可知，解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，尤其是在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～70%時，解吸率從59.68%增加到98.37%，但乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～95%時，解吸率增幅緩慢。綜合考慮解吸率和生產(chǎn)成本，選擇70%為最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 pH對吸附率的影響 由圖1C可知，吸附液的pH對樹脂的吸附有較大的影響，在pH 3.00時，樹脂的吸附率達到最大。總黃酮顯酸性，在酸性條件下呈分子狀態(tài)，以氫鍵方式被吸附，因而樹脂吸附率大，但若酸性過強，總黃酮易生成烊鹽，使吸附效果變差[10]。本試驗以pH 3.00的吸附液上柱。

2.2.4 作用時間對吸附率的影響 由圖1D可知，大孔樹脂對金絲草總黃酮的吸附為快速平衡型。在3 h后就幾乎不再吸附，吸附率為76.18%。8 h時吸附率為76.90%，增幅很小；最終24 h時的吸附率為78.48%，與3 h時的相差不大。因此，DA-201大孔樹脂對金絲草總黃酮具有良好的吸附動力學(xué)特性，吸附速度快，符合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

2.3 動態(tài)純化分離參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

吸附流速主要是影響溶質(zhì)在樹脂表面的擴散。如果流速太高，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂的表面，樹脂不能充分吸附溶質(zhì)。隨著吸附流速的加快，總黃酮的吸附量越來越少。綜合考慮總黃酮吸附率及工作效率，最終確定最佳的吸附流速為2 mL/min（圖2A）。由圖2B可知，當(dāng)上柱的吸附液體積為1/5個柱體積即5 mL時吸附趨于平衡，樹脂不再吸附。洗脫液的洗脫流速過快或者過慢都不好，洗脫流速過快，洗脫液還未來得及吸附總黃酮，就已流出層析柱；因而洗脫流速慢有利于對總黃酮的吸附，但是洗脫流速過慢耗時，在生產(chǎn)上很不經(jīng)濟，特別是大工業(yè)生產(chǎn)時大大增加了生產(chǎn)成本。因此洗脫流速應(yīng)首先保證大部分的總黃酮能基本被洗脫下來，洗脫流速越快越好[11]。由圖2C可知，最佳洗脫流速為2 mL/min。由圖2D可知，當(dāng)洗脫液體積為15 mL時，洗脫液中總黃酮濃度最高，當(dāng)體積為75 mL時，幾乎洗脫完全。考慮到洗脫液用量過多會增加洗脫時間，造成浪費，故確定以3個柱體積為最佳的洗脫液體積。

3 結(jié)論

根據(jù)5種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)特性所顯示的樹脂性能，DA-201大孔樹脂的綜合性能較佳，有較高的吸附率和解吸率，適合于金絲草總黃酮的吸附純化。

DA-201大孔樹脂對金絲草總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸優(yōu)化條件：吸附液pH 3.00，樹脂質(zhì)量與吸附液體積的比值為1∶10，洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%，恒溫振蕩時間3 h。

DA-201大孔樹脂動態(tài)純化分離金絲草總黃酮的工藝參數(shù)為：吸附液為1.203 5 mg/mL，吸附流速為2 mL/min，當(dāng)吸附液體積為1/5個柱體積時吸附趨于平衡，樹脂不再吸附。洗脫劑用量為3個柱體積，洗脫速度為2 mL/min，應(yīng)用DA-201大孔樹脂純化總黃酮得到了滿意的效果。

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