HPLC法測定離體葡萄葉中茋化物的含量

摘要：采用HPLC法測定新疆紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香無核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）離體葡萄葉片中的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、紫檀茋、ε-二聚體葡萄素4種茋化物的含量。結果表明，4種茋化物的線性關系良好，相關系數為0.999 0～0.999 3，平均回收率為90.2%～109.2%。新疆紅提和紫香無核離體葡萄葉片中4種茋化物含量不同，紅提葡萄葉茋化物含量相對較高，其中白藜蘆醇苷含量最高達23.73 μg/g。2種葡萄葉的茋化物含量依次均為白藜蘆醇苷>紫檀茋>白藜蘆醇>ε-二聚體葡萄素。高效液相色譜法靈敏度高，適用于葡萄葉中4種茋類化合物含量測定。

關鍵詞：新疆紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）；紫香無核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）；茋化物；離體葡萄葉；高效液相色譜法

中圖分類號：S132；O945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2411-03

茋類化合物是具有均二苯乙烯母核或其寡聚物一類化合物的總稱。1976年，Langcake和Pryce首次發現葡萄（Vitis riparia）的葉片受紫外線照射、機械損傷及真菌感染時白藜蘆醇會迅速增加，認為白藜蘆醇是在逆境或遭遇到病原侵害時分泌的一種植保素[1]。近年來，研究證實葡萄、花生、虎杖等植物材料中不但含有白藜蘆醇，而且含有云杉苷、ε-二聚體葡萄素（ε-viniferin）、紫檀茋等其他茋類化合物[2，3]。作為植保素的重要組成成分，茋類化合物除了能提高植物的抗病性外，還具有較好的藥理活性，譬如調脂、保肝、抗血栓和抗腫瘤作用[4]，而其中的白藜蘆醇則具有抗衰老、皮膚保健和美容功效[5，6]，其藥用價值受到廣泛關注。目前，白藜蘆醇主要通過植物提取、化學合成和植物組織細胞培養等方法獲得，其中從植物中提取的白藜蘆醇天然安全，符合人們“綠色消費”的要求。因此，天然白藜蘆醇具有廣闊的應用前景。

新疆葡萄資源極為豐富，為保證果實品質，葡萄種植期間需要多次除去植株外周葉，其中以采摘葡萄后越冬除葉操作產生的廢棄葉為最，每畝地最多可產生成噸葡萄葉。因此，葡萄葉作為茋類化合物的新資源，不僅具有較大的開發潛力，還可提高葡萄產業的附加值。但另一方面，利用HPLC法同時對多種茋類化合物檢測時常受到植物多酚的干擾，樣品需要液液萃取[7，8]等前處理，目前采用乙醇提取法，安全低毒，且可提取多種茋類化合物[9]。本研究通過超聲輔助提取和HPLC法，建立葡萄葉片中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、紫檀茋、ε-二聚體葡萄素4種茋類化合物的快速分析方法，為葡萄葉片的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采摘石河子秋季生長健壯、長勢一致的美國紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香無核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）的后期中間葉齡葡萄葉片（含葉柄，大小相近），用去離子水洗凈，在暗室中用1∶10（V/V）去離子水浸泡12 h，瀝干，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

白藜蘆醇（resveratrol，Res），白藜蘆醇苷（polydatin，PD）、紫檀茋標樣（Pterostilbene，PS）購于Sigma公司，純度≥98%；ε-二聚體葡萄素（ε-viniferin，ε-VF）購于云力西公司，純度≥98%。

95%（體積分數）乙醇，購于天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器

LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司），KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠），AB1042N型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-1000型旋轉蒸發儀 （上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 前處理 取冷凍紫香無核和紅提葉，迅速粉碎研磨，分別稱取5 g于燒杯中，加100 mL 70%（體積分數）乙醇[10]，超聲提取3次，合并提取液，濃縮干燥。用甲醇定容至10 mL后，過0.25 μm微孔濾膜，待測。

1.3.2 標準溶液的配制 分別稱取Res 1.2 mg，PD 1.9 mg，PS 1.3 mg和ε-VF 2.3 mg，定容至10 mL，配制成525、487、507、506 mmol/L的標準母液，備用。

1.3.3 色譜條件 色譜柱Atlantis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃，檢測波長為306 nm，進樣體積為20 μL。采用二元梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為去離子水（2‰磷酸，體積分數）；起始0.01 min時A為5%（體積分數，下同），B為95%；到20 min時A為15%，B為85%；50 min時A為30%，B為70%；到65 min時A為70%，B為30%；到70 min時停止。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

PD、Res、PS、ε-VF標準品的保留時間分別為34.247、45.579、58.561和64.583 min；標準品色譜圖和樣品提取液色圖譜分別見圖1A和圖1B。由圖1可知，本法可同時檢測樣品中的PD、Res、PS和ε-VF。

2.2 線性關系考察

精確吸取1～7 μL不同體積4種標準溶液，定容于10 mL，分別配成5～35 μmol/L標準工作液，記錄色譜圖及峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程，結果如表1所示。4種茋化物峰面積和濃度的相關系數為0.999 0～0.999 3，表明在設定濃度范圍內，線性關系良好。

2.3 方法學分析

精密度試驗：精確吸取一定量的標準母液，配制成500 μmol/L 工作液，每次進樣20 μL，連續進樣6次，計算峰面積RSD值。重復性試驗：精確稱取提同一樣品粉末6份，按供上述前處理和色譜分析方法平行操作，計算峰面積RSD值。穩定性試驗：取同一供試品溶液，每隔2 h進樣20 μL，共5次，計算峰面積RSD值，結果見表1。

2.4 回收率試驗

分別取冷凍發脆的葡萄葉片，粉碎研磨樣分為4份，1份直接測定，另外3份分別加入3個水平的Res、PD、PS和ε-VF標準品，每水平設3平行，考察本法回收率，結果見表2。由表2可知，該方法回收率為90.2%～109.2%，表明精密度良好。

2.5 不同品種葡萄葉樣品中茋類化合物含量比較

紫香無核葡萄葉、紅提葡萄葉中茋類化合物含量如表3所示。由表3可知，紅提PD的平均含量最高（23.73 mg/kg），紫香無核中ε-VF最低（1.05 mg/kg）。

3 小結與討論

一般條件下，葡萄中茋類化合物水平較低，新鮮葡萄皮中大約含50～100 mg/kg白藜蘆醇以及少量虎杖苷和白皮杉醇，紅皮葡萄中相關化合物含量較高。而葡萄藤莖中含有微量順式白藜蘆醇（3.5 μg/kg）及ε-viniferin（1.3 μg/kg），葡萄果肉中茋類化合物含量極低。葡萄葉片中含有少量的白藜蘆醇（0.06～46 mg/kg），且變化范圍較大。Park等[11]測定了葡萄葉片、種子、果皮等部位白藜蘆醇含量，發現葉片白藜蘆醇含量最高。Landrault等[12]與Bavaresco[13]發現葡萄葉、莖、果實中一些特殊活性的茋類化合物具潛在利用價值。另外，還有報道稱紅皮葡萄中白藜蘆醇的含量相對較高[14]。本研究比較了離體紅提和紫香無核葉片中的茋類化合物含量，發現紅提葡萄葉中茋類化合物含量高于紫香無核中的含量，該結果表明茋類化合物含量與品種有密切聯系。不同品種的茋類化合物含量雖然有差異，但各組分含量大小也呈現一定規律性，如白藜蘆醇苷>紫檀茋>白藜蘆醇>ε-二聚體葡萄素。上述結果表明在不同葡萄葉中茋類化合物積累的共性與個性特點。

綜上所述，本研究針對采摘后離體葡萄葉片中代表性茋類化合物，采用HPLC法對其進行分析，方法簡單、干擾小、靈敏度高、分析速度快，適用于葡萄葉中4種茋類化合物的同時快速檢測，為探討新疆北疆常見食用葡萄（美國紅提、紫香無核）中的茋類化合物含量提供參考。

參考文獻：

[1] LANGCAKE P， PRYCE R J. The production of resveratrol by Vitis vinirera and other members of the vitaccae as a response to infection or injury[J]. Physio Plant Path，1976，9（1）：77-86.

[2] PEZET R， PONT V. Identification of pterostilbene in grape berries of Vitis vinifera[J]. Plant Physiol Bioch，1988（26）： 603-607.

[3] PEZET R，PERRET C， JEAN DENIS J B， et al. δ-Viniferin， a Resveratrol Dehydrodimer： One of the Major Stilbenes Synthesized by Stressed Grapevine Leaves[J]. J Agric Food Chem， 2003， 51（18）： 5488-5492.

[4] JEANDET P，BESSIS R，MAUME BF， et al. Effect of enoiogical practices on the resveratrol isomer content of wine[J]. Agric Food Chem，1995，43（2）：316-319.

[5] 郜海燕，于震宇，陳杭君，等. 白藜蘆醇功能和作用機理研究進展[J]. 中國食品學報，2006，6（1）：411-416.

[6] 韓晶晶，劉 煒，畢玉平. 白黎蘆醇的研究進展[J]. 生物工程學報，2008，4（11）：1851-1859.

[7] JEANDET P， DOUILLET BREUIL A C， et al. HPLC analysis of grapevine phytoalexins coupling photodiode array detection and fluorometry[J]. Anal Chem，1997，69（24）：5172-5177.

[8] MORENO-LABANDA J F，MALLAVIA R，PEREZ-FONSL，et al. Determination of piceid and resveratrol in Spanish wines deriving from Monastrell （Vitis vinifera L.） grape variety[J]. J Agric Food Chem，2004，52（17）：5396-5403.

[9] 周煥霞，秦 杰，文連奎. 微波輔助提取花生紅衣中白藜蘆醇工藝的研究[J]. 農產品加（學刊），2010，2（199）：26-29.

[10] 王世盛，趙偉杰，劉志廣.天然多羥基芪類化合物的生物活性[J].國外醫藥（植物藥分冊），2001，16（1）：9-11.

[11] PARK H， KO JM， AN NR， et al. Contents of trans-resveratrol in Korean grape cultivars， including ‘Kyoho’[J]. Plant Biol，2009，52（4）：319-324.

[12] LANDRAULT N， LARRONDE F， DELAUNAY J C， et al. Levels of stibene oligomers and astilbin in French varietal wines and in grapes during Noble Rot development[J]. Agric Food Chem，2002，50（7）：2046-2052.

[13] BAVARESCO L. Role of viticultural factors on stilbene concentrations of grapes and wine[J]. Drugs Exp Clin Res，2003， 29（5-6）：181-187.

[14] 陳鎮泉，林嬌健，陳君琛，等. 科學新發現與葡萄新品種[J]. 葡萄栽培酒，1997（3）：54-561.