粘質(zhì)沙雷氏菌α—乙酰乳酸脫羧酶基因的體外表達(dá)

摘要：根據(jù)GenBank中α-乙酰乳酸脫羧酶的基因序列（slaA）設(shè)計(jì)引物，以粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）HU1基因組DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了目標(biāo)基因，全長(zhǎng)為780 bp。將該基因分別連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a和畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA，并在對(duì)應(yīng)的宿主中進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)果表明，大腸桿菌和畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物的最適溫度和pH均分別為40 ℃和7，兩者在不同pH下的穩(wěn)定性也相似，只不過(guò)畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性要略強(qiáng)于大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；α-乙酰乳酸脫羧酶；體外表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2431-04

在啤酒工業(yè)中，雙乙酰含量是衡量啤酒成熟與否的重要指標(biāo)，該物質(zhì)主要由合成纈氨酸的中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸在酵母細(xì)胞外經(jīng)非酶氧化脫羧而產(chǎn)生。由于過(guò)多的雙乙酰會(huì)帶來(lái)令人不愉快的餿飯味，工程技術(shù)人員會(huì)使用相關(guān)的手段和工藝降低啤酒中的雙乙酰濃度到一定范圍內(nèi)[1]。α-乙酰乳酸脫羧酶能夠降低啤酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的雙乙酰，縮短熟化期，改善啤酒口味，加速啤酒的成熟。但是啤酒酵母菌自身不能產(chǎn)生α-乙酰乳酸脫羧酶[2]，將α-乙酰乳酸脫羧酶基因整合到啤酒酵母染色體中表達(dá)是降低啤酒中雙乙酰濃度的措施之一[3-6]。外源表達(dá)的α-乙酰乳酸脫羧酶已經(jīng)作為一種成熟的酶制劑產(chǎn)品被直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，可以有效地控制啤酒中的雙乙酰濃度。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上α-乙酰乳酸脫羧酶的品牌產(chǎn)品很多，國(guó)外代表有丹麥的諾維信公司（Novozymes）的產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)代表有邢臺(tái)酶制劑廠、廣西大學(xué)、南寧富谷科技有限公司以及保定滿城金星化工有限公司的產(chǎn)品。本研究從粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）克隆到了α-乙酰乳酸脫羧酶基因，并在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行體外表達(dá)，結(jié)果表明該酶具有較為樂(lè)觀的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粘質(zhì)沙雷氏菌HU1、大腸桿菌（Escherichia coli Top10、BL21）、畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pET30a、pPICZαA由湖北大學(xué)湖北省工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶與試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA快速連接試劑盒、高保真PCR聚合酶Primestar等均購(gòu)自TaKaRa公司，基因組抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega生物技術(shù)公司，其他抗生素和化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或者進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、YPD、MD、BMGY、BMMY見(jiàn)畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2 方法

1.2.1 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的擴(kuò)增 根據(jù)α-乙酰乳酸脫羧酶基因（slaA）序列選擇適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。

1.2.2 序列測(cè)定與分析 將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體上，構(gòu)建測(cè)序質(zhì)粒pMD18T-slaA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 α-乙酰乳酸脫羧酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及產(chǎn)物鑒定 首先根據(jù)測(cè)序得到的α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列，引入酶切位點(diǎn)Nco I/Hind III設(shè)計(jì)大腸桿菌表達(dá)載體引物。將用該引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化并雙酶切，與經(jīng)同樣的內(nèi)切酶處理后的載體pET30a連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子并鑒定。將鑒定得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-slaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上的單克隆接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中振蕩過(guò)夜，然后按照體積比1∶50的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的LB培養(yǎng)液中，待培養(yǎng)液吸光度為0.5左右時(shí)，于30 ℃用IPTG誘導(dǎo)。用超聲波破菌，進(jìn)行SDS-PAGE電泳[7]。

1.2.4 α-乙酰乳酸脫羧酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及產(chǎn)物鑒定 根據(jù)α-乙酰乳酸脫羧酶基因設(shè)計(jì)畢赤酵母表達(dá)載體引物，分別引入酶切位點(diǎn)EcoR I/Not I，以粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化的PCR產(chǎn)物和載體pPICZαA分別用EcoR I和Not I雙酶切，然后連接并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含25 mg/L Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。將讀碼框正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化于畢赤酵母GS115中，轉(zhuǎn)化條件為1.5 kV、25 μF、200 Ω。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有100 mg/L Zeocin的YPD平板上，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子接種于100 mL BMGY生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，于30 ℃以220 r/min培養(yǎng)2 d，以5 000 r/min離心10 min，收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至50 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，用以上條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為5%。每12 h取樣，以5 000 r/min離心5 min，收集上清液，為粗酶液。

1.2.5 α-乙酰乳酸脫羧酶的活性分析 將大腸桿菌或者畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物用鎳凝膠親和層析法純化后測(cè)定活性，測(cè)定方法如下：取150 μL一定濃度的待測(cè)樣品加入50 μmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 6.2），混勻加入50 μL的水解底物溶液，室溫放置10 min。立即加入250 μL 2.5 mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)。在上述反應(yīng)液中加入4.5 mL肌酸-萘酚溶液，于室溫顯色反應(yīng)1 h，測(cè)定吸光度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的PCR擴(kuò)增及其生物信息學(xué)分析

根據(jù)Serratia marcescens MG1和S. marcescens H30的α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列[9]設(shè)計(jì)引物，以抽提的S. marcescens HU1總DNA為模板，用引物擴(kuò)增α-乙酰乳酸脫羧酶基因，擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果與理論結(jié)果吻合。該片斷的測(cè)序結(jié)果表明該基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為780 bp，編碼260個(gè)氨基酸。通過(guò)PEPTOOL工具分析可知，該α-乙酰乳酸脫羧酶成熟蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為28.9 ku，等電點(diǎn)為5.38。BLAST比對(duì)結(jié)果表明該蛋白質(zhì)序列與Vibrio cholerae，Klebsiella terrigena和Bacillus subtilis中的α-乙酰乳酸脫羧酶同源性分別達(dá)到74%、74%和67%。

2.2 α-乙酰乳酸脫羧酶基因表達(dá)質(zhì)粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA的構(gòu)建

將擴(kuò)增的α-乙酰乳酸脫羧酶基因克隆到pET30a載體上，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET30a-slaA，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明重組質(zhì)粒經(jīng)Nco I/Hind III雙酶切后產(chǎn)生與目的基因同樣大小的條帶和載體的條帶，表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因已經(jīng)成功克隆到pET30a載體中。同樣將該基因克隆到pPICZαA上，結(jié)果表明，pPICZαA-slaA經(jīng)過(guò)EcoR I/Not I雙酶切后產(chǎn)生同α-乙酰乳酸脫羧酶基因同樣大小的產(chǎn)物以及載體片段，結(jié)果表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因已成功克隆到pPICZαA載體中。重組質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明讀碼框正確，可以進(jìn)行下一步的表達(dá)試驗(yàn)。

2.3 α-乙酰乳酸脫羧酶表達(dá)菌株的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pET30a-slaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將重組質(zhì)粒pPICZαA-slaA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在含100 mg/L Zeocin的YPD培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。酵母轉(zhuǎn)化子通過(guò)PCR驗(yàn)證表明基因組中已經(jīng)整合了α-乙酰乳酸脫羧酶基因。配制含不同濃度Zeocin的YPD培養(yǎng)基，將篩選得到的轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含250、500、1 000 mg/L Zeocin的平板上，于30 ℃下培養(yǎng)2～3 d，篩選能在高濃度Zeocin下生長(zhǎng)的菌株。得到的菌株基因組中可能含有多個(gè)拷貝數(shù)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因。

2.4 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的表達(dá)與SDS-PAGE分析

含有重組質(zhì)粒pET30a-slaA的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集細(xì)胞，用超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，重組菌和對(duì)照菌株（pET30a）相比較，在約29 ku處增加了一條蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)測(cè)的基因表達(dá)產(chǎn)物一致（圖1A）。將在高濃度Zeocin平板上生長(zhǎng)的GS115（pPICZαA-slaA）轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，用甲醇誘導(dǎo)3 d，取樣離心，上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，重組畢赤酵母菌株的發(fā)酵上清液比對(duì)照菌株的發(fā)酵上清液多了一個(gè)29 ku的蛋白質(zhì)條帶，該條帶與目的基因表達(dá)產(chǎn)物一致（圖1B）。兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因的大腸桿菌和畢赤酵母重組表達(dá)菌株均已成功構(gòu)建。

2.5 溫度對(duì)重組α-乙酰乳酸脫羧酶活的影響

用鎳柱將兩種宿主表達(dá)的酶純化后，分別在不同的溫度下測(cè)定大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的酶活。由圖2A可知，大腸桿菌表達(dá)的α-乙酰乳酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在50～60 ℃維持40%以上的酶活；由圖2B可知，畢赤酵母表達(dá)的α-乙酰乳酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在50 ℃還有90%以上的酶活。

2.6 pH對(duì)重組α-乙酰乳酸脫羧酶活的影響

分別測(cè)定大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)的重組α-乙酰乳酸脫羧酶在不同pH下的酶活。由圖3A可知，大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物的最適反應(yīng)pH為7，在pH 6、8維持70%以上的酶活，在pH 9維持40%以上的酶活，而pH超過(guò)11就基本沒(méi)有酶活了。由圖3B可知，畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物的最適反應(yīng)pH為7，在pH 6、8可以維持60%左右的酶活，在pH 9～10可以維持30%以上的酶活。

2.7 重組α-乙酰乳酸脫羧酶的溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將純化后的兩種來(lái)源的α-乙酰乳酸脫羧酶在不同溫度下分別水浴處理0、5、10、15、20、25、30 min，之后測(cè)定酶活，以未處理的作為對(duì)照，得到α-乙酰乳酸脫羧酶的相對(duì)酶活穩(wěn)定性曲線。由圖4A可知，大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物在30 ℃較為穩(wěn)定，處理30 min時(shí)還保持有80%左右的相對(duì)酶活；40 ℃時(shí)相對(duì)酶活就變的十分不穩(wěn)定，處理30 min后相對(duì)酶活只剩10%。而圖4B則表明畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物在30 ℃和40 ℃都較為穩(wěn)定，處理30 min時(shí)還保持有70%左右的相對(duì)酶活；50 ℃時(shí)相對(duì)酶活開(kāi)始變的十分不穩(wěn)定，處理30 min時(shí)相對(duì)酶活只剩20%。

2.8 重組α-乙酰乳酸脫羧酶的pH穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

酶經(jīng)不同pH的緩沖液處理，于4 ℃過(guò)夜，測(cè)定相對(duì)酶活，得到pH穩(wěn)定性曲線。由圖5可知，大腸桿菌表達(dá)的重組α-乙酰乳酸脫羧酶相對(duì)酶活在pH 5～8的范圍內(nèi)能保持50%以上，而在pH 6～7之間比較穩(wěn)定，相對(duì)酶活保持在80%以上。與之對(duì)應(yīng)的是，畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的pH穩(wěn)定性與大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物相似。

3 小結(jié)與討論

α-乙酰乳酸脫羧酶已經(jīng)被廣泛地用在啤酒工業(yè)中，為此克隆和研究不同來(lái)源和性質(zhì)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因具有極大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究首次將粘質(zhì)沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脫羧酶基因在大腸桿菌和畢赤酵母兩種宿主中進(jìn)行了表達(dá)，并且研究了其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明大腸桿菌和畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物的最適溫度和pH均分別為40 ℃和7，兩者在不同pH下的穩(wěn)定性也相似，只不過(guò)畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性要略強(qiáng)于大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物。這些結(jié)論表明大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物性質(zhì)并沒(méi)有很大的區(qū)別，這個(gè)可能與α-乙酰乳酸脫羧酶基因上沒(méi)有糖基化位點(diǎn)和其他修飾位點(diǎn)存在有關(guān)，因而兩種宿主對(duì)于該基因的翻譯和修飾相近。但是考慮到畢赤酵母能夠?qū)⑼庠吹鞍追置诘桨猓档土似浜罄m(xù)生產(chǎn)和純化的難度，節(jié)約了成本，從而具有更廣闊的前景。研究為將粘質(zhì)沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脫羧酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)打下了基礎(chǔ)。

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