銅、鎘及其聯(lián)合毒性對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因表達(dá)影響

摘要：運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同暴露時(shí)間和暴露濃度的銅、鎘單一毒性和其聯(lián)合毒性對(duì)唐魚（Tanichthys albonubes）肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，銅和鎘對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用（P<0.05）；與單一毒性相比，銅鎘聯(lián)合毒性表現(xiàn)為一定的協(xié)同作用。唐魚CYP3A基因的表達(dá)變化對(duì)鎘、銅脅迫的響應(yīng)具有一定的可測(cè)性和較強(qiáng)的規(guī)律性。

關(guān)鍵詞：唐魚（Tanichthys albonubes）；CYP3A基因；RT-PCR；聯(lián)合毒性

中圖分類號(hào)：S949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2439-04

細(xì)胞色素P450氧化酶（Cytochmme P450 enzymes，CYP450）主要存在于動(dòng)物肝臟中，是一類重要的混合功能氧化酶（mixedfunctionoxidase，MFO）[1]，對(duì)許多內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化具有重要的作用[2]。CYP3A是魚類代謝親脂性有機(jī)化合物的主要氧化酶[3]，也是動(dòng)物肝臟中含量最豐富的CYP450酶，很多藥物或環(huán)境因子是CYP3A的誘導(dǎo)劑或抑制劑[4]。研究CYP3A在生物體內(nèi)的變化與污染物濃度的關(guān)系對(duì)環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)和預(yù)警具有重要意義。

唐魚（Tanichthys albonubes）又名白云金絲魚，隸屬于鯉形目鯉科。由于唐魚飼養(yǎng)條件要求低、性成熟早、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、病害少、管理?xiàng)l件簡(jiǎn)單，并且對(duì)于許多污染物較敏感，而有望作為一種新的水環(huán)境監(jiān)測(cè)生物加以開發(fā)研究。然而，關(guān)于唐魚的水生態(tài)毒理學(xué)研究還僅限于急性毒性及安全濃度評(píng)價(jià)等方面。本研究運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同暴露時(shí)間和暴露濃度的銅、鎘單一毒性及其聯(lián)合毒性對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因表達(dá)量的影響，為銅、鎘作為淡水魚類生態(tài)毒性的生物分子指示物提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)唐魚[體長（2.85±0.17） cm，體重（0.59±0.18） g]由中國水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所提供，已于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)2代以上，每天投喂熱帶魚薄片飼料（德國德彩水族公司生產(chǎn)）兩次，水溫控制在（25.0±1.0）℃，光暗比為14 h∶10 h，飼養(yǎng)期間魚活動(dòng)正常、無病，死亡率低于3%。

1.1.2 試劑 Trizol，Premix Taq DNA聚合酶，dNTP Mixture，Ribonuclease Inhibitor，Oligo d（T）15 Primers，Agarose Gel DNA Purification Kit，pMD19-T Vector，SYBR Premix Taq DNA聚合酶，PrimeScript RT-PCR Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司；DEPC濃縮液、X-Gal、IPTG和氨芐青霉系購自天根生化科技（北京）有限公司；CuSO4·5H2O，CdCl2·2.5H2O等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 試驗(yàn)所用引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物列表如表1。

1.2 方法

1.2.1 唐魚總RNA的提取 將唐魚沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行解剖，剖取肝臟組織塊約50 mg。采用Trizol法提取唐魚總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA質(zhì)量。

1.2.2 CYP3A基因的克隆 根據(jù)GenBank上的鯽魚（Carassius auratus）（JN555609）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）（EU106659）、錦鯉（Cyprinus carpio）（GU046696）CYP3A基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物CYP3A-F和CYP3A-R。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT-PCR Kit進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增CYP3A基因。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，Premix Taq DNA聚合酶25 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑選陽性菌落檢測(cè)目的片段，并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 唐魚重金屬暴露處理 根據(jù)陳輝輝等[5]的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，Cu2+對(duì)唐魚96 h的半數(shù)致死濃度為0.054 mg/L，Cd2+對(duì)唐魚96 h的半數(shù)致死濃度為4.610 mg/L，確定了銅和鎘的亞急性試驗(yàn)濃度。銅暴露試驗(yàn)設(shè)0（對(duì)照組）、13.50、27.00 μg/L（分別為96 h半致死濃度的0%、25%和50%）3個(gè)處理組。鎘暴露試驗(yàn)設(shè)0（對(duì)照組）、1.15、2.30 mg/L（分別為96 h半致死濃度的0%、25%和50%）3個(gè)處理組。銅、鎘聯(lián)合暴露為在單一毒性的基礎(chǔ)上，按毒性單位1∶1設(shè)置3個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行。取暫養(yǎng)兩周的健康唐魚648尾，分別放入27個(gè)缸中，每缸24尾，水中溶氧量保持在6.0 mg/L以上，pH 8.0，硬度 2.5 dH（德國度），溫度（25.0±1.0）℃，光暗比為14 h∶10 h。試驗(yàn)共進(jìn)行96 h，試驗(yàn)期間不投喂飼料，并未引起死亡。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)重金屬暴露后mRNA的表達(dá)量 根據(jù)已獲得的核心片段序列，設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物RT-F和RT-R，根據(jù)已報(bào)道的唐魚β-actin基因（NO. EU128481.1）設(shè)計(jì)特異性內(nèi)參引物β-F和β-R。暴露后的24、48、72、96 h分別取銅、鎘及其聯(lián)合毒性不同濃度各處理組每組6尾魚，剖取等量的肝臟提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2.0 μL，上下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，SYBR Premix Taq DNA聚合酶12.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2■法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。以無處理組24 h肝臟組織CYP3A基因表達(dá)量為對(duì)照，并設(shè)其基因的相對(duì)表達(dá)量為l。試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用STATISTICA 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用Duncan’S多重比較對(duì)均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐魚CYP3A基因核心片段的克隆

利用RT-PCR進(jìn)行核心片段擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小一致的目的片段（圖1）。將序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，該序列與鯽魚、錦鯉、稀有鮈鯽同源性分別為86%、87%、90%。

2.2 銅暴露下唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)量變化結(jié)果

銅對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)的影響情況見圖2。由圖2可知，低劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平在48 h顯著上調(diào)（約為對(duì)照組的3.8倍，P<0.05），72 h下降后96 h對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（約為對(duì)照組的4.6倍，P<0.05）；高劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平整體在48 h顯著上調(diào)（約為對(duì)照組的2.5倍，P<0.05），72 h和96 h CYP3A基因mRNA表達(dá)水平與48 h無顯著性差異，高劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平整體上低于低劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平。CYP3A基因mRNA表達(dá)水平與銅暴露時(shí)間無顯著性相關(guān)關(guān)系。

2.3 鎘暴露下唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)量變化

鎘對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)的影響情況見圖3。 由圖3可知，低劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平在48 h表現(xiàn)為極顯著上調(diào)并達(dá)到峰值（約為對(duì)照組的12倍，P<0.01），隨后呈下降趨勢(shì)，96 h又達(dá)到顯著上調(diào)水平（約為對(duì)照組的7.7倍，P<0.05）；高劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平在24 h和48 h與對(duì)照組均無顯著差異（P>0.05），72 h達(dá)到顯著上調(diào)水平（約為對(duì)照組的8.2倍，P<0.05），96 h有所下降，但仍與對(duì)照組差異顯著（約為對(duì)照組的3.6倍，P<0.05）。與銅暴露一樣，鎘暴露下48 h和96 h唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)了先高后低的上調(diào)作用。

2.4 銅、鎘聯(lián)合暴露下唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)量變化

銅、鎘聯(lián)合毒性對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因mRNA表達(dá)的影響情況見圖4。由圖4可知，聯(lián)合處理的低劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平在48 h極顯著上調(diào)（約為對(duì)照組的14.4倍，P<0.01），隨著暴露時(shí)間的增加，CYP3A基因mRNA表達(dá)量有所降低，96 h與對(duì)照組相比，仍有顯著差異（約為對(duì)照組的6.8倍，P<0.05）；聯(lián)合處理的高劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平在24 h和48 h內(nèi)與對(duì)照組無顯著性差異，72 h和96 h與對(duì)照組均有顯著性差異（分別約為對(duì)照組的4.8倍和4.3倍，P<0.05）。聯(lián)合處理的各劑量組CYP3A基因mRNA表達(dá)水平相較于銅、鎘單一毒性處理表現(xiàn)出了更高的上調(diào)水平。

3 小結(jié)與討論

韓華等[6]研究了4種水產(chǎn)藥物對(duì)牙鲆肝細(xì)胞P450酶的影響，發(fā)現(xiàn)3種水產(chǎn)用喹諾酮類藥物對(duì)牙鲆CYP1A和CYP3A的酶活性均有不同程度地抑制作用，并且不同濃度的中藥黃芩苷對(duì)牙鲆肝細(xì)胞CYP1A的酶活性和基因表達(dá)隨著用藥時(shí)間和劑量的增加而加強(qiáng)。陳秀榮等[7]證明了CYP3A酶分布于草魚肝臟、鰓、腎臟、脾、腸、腦等各組織中，氰戊菊酯在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)能顯著抑制CYP3A的活性，這種抑制隨暴露時(shí)間的延長而增強(qiáng)，但抑制趨勢(shì)減弱。Grosvik等[8]指出鰻鱺中EROD活性能夠指示BaP、PCB污染水平。Haasch等[9]在酶活性、蛋白、mRNA幾個(gè)水平上測(cè)定了被PAH和PCB污染的河水對(duì)魚CYPlAl的誘導(dǎo)，證明了幾種水平上的測(cè)定都可用于P450酶誘導(dǎo)作用的檢測(cè)。銅是生命必需的微量元素，然而高劑量銅具有凝聚蛋白質(zhì)和腐蝕作用。大量銅元素在動(dòng)物組織細(xì)胞中蓄積，尤其是在肝臟中蓄積，使多種重要酶的活性受到抑制，導(dǎo)致肝臟功能障礙甚至壞死。鎘會(huì)阻礙生物體內(nèi)一定的活性傳遞機(jī)制，影響機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成腎損傷和酶失活[10]，并能誘導(dǎo)金屬硫蛋白的形成。

本研究是國內(nèi)首次報(bào)道唐魚細(xì)胞色素P450酶家族CYP3A，對(duì)于魚類CYP家族基因功能研究具有一定意義。單獨(dú)的銅、鎘暴露對(duì)唐魚肝臟CYP3A基因表達(dá)量均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，且低濃度暴露誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，高濃度暴露誘導(dǎo)作用減弱。不同濃度的銅、鎘聯(lián)合暴露下唐魚肝臟CYP3A基因表達(dá)量相較于單一重金屬暴露均有不同程度的增加，表現(xiàn)為一定的協(xié)同作用。目前研究水體污染物聯(lián)合毒性的方法和模型多只限于急性毒性評(píng)價(jià)[11]，主要運(yùn)用單一污染物的LC50值建立各種模型，根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算來判別混合污染物的聯(lián)合作用，如Tu（毒性單位）法，AI（加和指數(shù)）法、MTI（混合毒性指數(shù)）法及λ（相似參數(shù)）法，在基因表達(dá)及蛋白表達(dá)等更深層次的水平上卻沒有統(tǒng)一的較好的評(píng)價(jià)模型和標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立更科學(xué)的污染物評(píng)價(jià)模型和方法，對(duì)于污染物的毒性評(píng)價(jià)有著更重要的意義。

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