乳腺癌HER2蛋白陽性表達的基因狀態及其與P53蛋白相關性研究

[摘要]目的 研究乳腺癌HER2蛋白表達陽性的基因狀態及其與P53蛋白相關性，探討其與乳腺癌發生、發展的內在關系。方法 選取257例HER2蛋白表達陽性的浸潤性乳腺癌樣本，分別應用熒光原位雜交（FISH）法和免疫組織化學EliVisionTMplus法對標本中的HER2基因和P53蛋白、ER和PR受體進行檢測并做相關性分析。 結果 ①HER2基因擴增率64.59%（166/257）；其中IHC（2+）56.48%（109/193），（3+）89.06%（57/64）；HER2基因擴增和其蛋白陽性表達比較有顯著相關性（P < 0.01）。②P53蛋白表達率52.92%（136/257），P53蛋白表達率、HER2基因擴增率與ER、PR受體表達及腋窩淋巴結轉移差異有顯著性（P < 0.05）；與腫瘤大小、病理學類型、年齡無統計學意義（P > 0.05）。 結論 HER2基因擴增率與P53蛋白表達率呈正相關，兩者指標的聯合檢測對乳腺癌的轉移、預后評估具有重要的參考意義。

[關鍵詞] 乳腺腫瘤；HER2；P53蛋白；免疫組織化學；熒光原位雜交

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）33-0113-03

隨著科研的發展，分子生物學指標作為癌癥發展、治療及預后評估的價值取得了長足發展，受到越來越多的國內外學者高度重視。HER2基因位于人17號染色體長臂21位，編碼一種與人表皮生長因子受體高度同源的酪氨酸激酶受體，在乳腺癌的侵襲、治療、預后評估中起著重要作用。選取我院257例HER2蛋白表達陽性的浸潤性乳腺癌手術切除標本，采用熒光原位雜交（FISH）法檢測標本中的HER2基因擴增狀態，探討其與P53蛋白表達及臨床預后因素的關系。

1資料與方法

1.1病例資料

收集我院病理科2010年10月～2013年6月外檢手術切除浸潤性乳腺癌根治病例，篩選出257例HER2蛋白陽性表達標本，其中HER2蛋白（2+）193例，（3+）64例，患者均為女性，年齡26～79歲，平均51歲。病理類型包括浸潤性導管癌224例，伴髓樣特征的浸潤性癌15例，浸潤性微乳頭狀癌10例，大汗腺癌8例。

1.2 免疫組織化學檢測（IHC）

采用EliVisionTMplus法染色，所用HER2蛋白、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和P53蛋白抗體試劑盒均采購自福建邁新公司。手術切除標本均10%中性福爾馬林固定，經脫水石蠟包埋，4μm連續切片，于65℃烤箱烤片2h，脫蠟、水化，檸檬酸鹽高壓修復，按照試劑盒操作說明書步驟嚴格執行。實驗以預知陽性標本作為陽性對照，PBS替代一抗為陰性對照。結果判定：HER2判讀標準 0：全部癌細胞中細胞膜無著色者；1+：任何比例癌細胞呈現微弱或不完整的細胞膜著色者；2+：>10%癌細胞呈現輕-中度、完整但不均勻的細胞膜著色或<30%癌細胞呈現強而完整的細胞膜著色者；3+：≥30%癌細胞呈現強而完整的細胞膜著色者。ER、PR和P53判讀標準：陽性著色部位均為癌細胞核。癌細胞總數<5%著色為0；5%～25%著色為1+；26%～50%著色為2+，50%以上著色為3+。

1.3 熒光原位雜交（FISH）

HER2基因探針試劑盒及蛋白酶購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。方法：取上述4μm切片60℃烤片過夜，脫蠟、梯度水化，于蒸餾水煮沸30min，37℃蛋白酶消化，滴加探針后83℃變性5min，42℃雜交過夜，洗滌干燥，DAPI復染，熒光顯微鏡下觀察。結果判讀：HER2基因信號顯示為橘紅色，17號染色體著絲粒信號顯示為綠色，計數30個癌細胞，分別統計橘紅色信號與綠色信號總數值，然后計算其比值。比值<1.8者歸入陰性，視為無基因擴增；比值>2.2或眾多橘紅色信號成簇分布者歸入陽性，視為基因擴增；比值1.8～2.2 者，擴大癌細胞計數到100個或重新檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件分析。采用非參數檢驗判斷HER2基因擴增與蛋白表達狀況及與年齡、腫瘤大小、病理學類型、淋巴結轉移和ER、PR表達的相互關系；以P < 0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌HER2基因擴增和HER2蛋白表達的關系

本組257例浸潤性乳腺癌，HER2基因擴增（圖1）率64.59%，分別為HER2蛋白（2+）（圖2）193例，HER2基因擴增109例，占比56.46%。HER2蛋白（3+）（圖3）64例，HER2基因擴增57例，占比89.06%。統計結果顯示，比較HER2基因擴增與HER2蛋白不同強度的表達，差異具有統計學意義（P < 0.01）。見表1及圖1～4。

2.2 HER2基因擴增與P53蛋白表達及預后因素的關系

HER2基因擴增和P53蛋白表達（圖4）與乳腺癌患者發病年齡、腫瘤大小、病理學類型無關（P > 0.05）。HER2基因擴增和P53蛋白表達與患者腋窩淋巴結轉移、ER和PR受體表達差異有顯著性（P < 0.05）。見表 2 。

3 討論

乳腺癌是嚴重危害女性健康與生命的常見惡性腫瘤之一[1]，多種發病機制中，20%～30%的患者與HER2蛋白過表達或基因 擴增有關，并且HER2狀態還是靶向曲妥珠單抗藥物治療有無反應的關鍵指標，所以準確的HER2檢測結果非常重要[2]。檢測HER2狀態的方法主要有免疫組織化學（HC）和熒光原位雜交（FISH）。IHC檢測HER2蛋白，目前臨床上開展最為普遍，它具有操作過程容易掌握、實驗成本低等優點，但是其結果容易受到組織固定、技術操作、切片判讀等多種環節的影響。FISH檢測HER2基因擴增，其結果穩定、可靠，受影響小，成本較高，被認為是目前最準確、可重復性最高的方法[3]。

本研究結果顯示，HER2結果IHC2+中FISH陽性率56.48%，與國外學者的研究數據有差異[4，5]。HER2結果IHC3+中FISH陽性率89.06%，與國外學者研究數據相近。多數情況下，HER2蛋白過表達與DNA擴增同時發生，但由于腫瘤細胞17號染色體多體[6]或因IHC蛋白檢測過程容易受到多種外在環節影響等原因，常出現HER2蛋白過表達與FISH檢測結果不一致的情況，因此我們建議，HER2蛋白陽性病人均應進行FISH檢測，明確基因狀態。本研究中HER2蛋白2+的FISH陽性率偏高于國外學者數據，可能與樣本量小、地域人群差異或對切片判讀標準把握不同有關。

P53基因分為野生型和突變型。編碼正常的P53基因（野生型）是與人類腫瘤的發生、發展高度相關的抑癌基因，正常組織中一般不表達。突變型P53基因失去野生型P53基因的生物活性，不能修復細胞受損DNA，導致細胞發生癌變[7]，應用IHC方法只能檢測突變型P53蛋白表達。本研究結果表明，在ER、PR受體陰性組及發生腋窩淋巴結轉移組中，HER2基因擴增與P53蛋白表達明顯高于ER、PR受體陽性組及腋窩淋巴結無轉移組（P < 0.05），顯示HER2基因擴增和P53蛋白表達呈正相關。同時本研究也表明兩者與患者年齡、腫瘤大小、病理學類型無相關性（P > 0.05）。本研究結果中，同時具有HER2基因擴增和P53蛋白表達者，更多發生高陰性激素受體狀態和淋巴結轉移情況，揭示患者預后不良。乳腺癌的發生、進展機制不明，其過程可能是多種癌基因、抑癌基因相互作用、影響的結果，而兩者在其中是否起到某種共同參與協同作用有待更深入研究。

綜上所述，HER2蛋白陽性患者均應進行HER2基因檢測，HER2基因擴增與P53蛋白表達呈正相關，兩者聯合檢測對乳腺癌轉移、預后評估具有重要參考意義。

[參考文獻]

[1] Jemal A，Slegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009[J].Ca Cancer J Clin，2009，59（4）：225-249.

[2] Rosenberg CL.Polysomy 17 and HER2 amplification：True，true，and unrelated[J].J Clin Oncol，2008，26（30）：4856-4858.

[3] Sauter G，Lee J，Bartlett JM，et al.Guidelines for human epidermal growth fator receptor 2 lesting：Biologic and methodologic considerations[J].Clin Oncol，2009，27（8）：1323-1333.

[4] Dolan M，Snover D.Comparison of immunohistochmical and fluorescence in situ hybridization assessment of HER-2 status in routine practice[J].Am JClin Pathol，2005，123（5）：766-770.

[5] Lan C，Liu JM，Liu TW. Erb-b2 amplification by fluorescence in situ hybridization in breast cancer specimens read as 2+ in immunohistochemical analysis[J].Am J Clin Pathol，2005，124（1）：97-102.

[6] Hammock L，Lewis M，Phillips C，et al.Strong HER2/neu protein overexpression by immunohistochemistry often does not predict oncogene amplification by fluorescence in situ hybridization[J].Hum Pathol，2003，34（10）：1043-1047.

[7] Hu H，El-Gewely MR.Differentally expressed downstream genes in cells with normal or mutated p53[J].Oncol Res，2003，13（6210）：429-436.

（收稿日期：2013-08-14）