TRAIL、c—FLIP在大腸癌與轉移淋巴結中的表達及意義

[摘要] 目的 檢測TRAIL、c-FLIP在結直腸癌中的表達情況，探討二者在大腸腫瘤的浸潤轉移及凋亡調控機制的可能相互關系和作用。 方法 選取新鮮結直腸癌、配對的癌旁正常組織各85例及轉移淋巴結51例，運用MaxVision免疫組化和Western blot蛋白定量檢測TRAIL、c-FLIP在各組間的表達，所得結果進行統計學分析。 結果 （1）TRAIL在結直腸癌組織中的定位及表達位于細胞膜及細胞漿，而c-FLIP主要位于細胞漿。（2）TRAIL在癌組、轉移淋巴結（LNM）組與癌旁正常組的均廣泛表達，三者比較差異無統計學意義（P>0.05）；癌組中，未/低分化陽性表達與中高分化比較、無LNM組與LNM組比較差異無統計學意義（P>0.05）；（3）c-FLIP在癌組陽性表達明顯高于正常組（且無一例強染色）；轉移淋巴結組陽性表達亦明顯高于正常組，其強陽性表達88.2%（45/51），與癌組比較差異無統計學意義（P>0.05）。其癌組中未發生淋巴轉移陽性表達88.2%（30/34）、淋巴轉移100%（51/51）、未/低分化和中高分化分別為96.8%（30/31）、94.4%（51/54），81例陽性表達中強陽性74%（60/81）；未/低分化腺癌與中高分化組表達比較差異無統計學意義（P>0.05）。（4）Western blot蛋白定量檢測發現，對于TRAIL，呈現出c-FLIP蛋白表達越高，其表達也反應性增高的趨勢，TRAIL蛋白的表達與c-FLIP的表達呈相互拮抗性正相關。 結論 （1）c-FLIP在結直腸癌組織和轉移淋巴結中存在過高表達，在正常組織低表達或不表達，而TRAIL在癌組織和轉移淋巴結組織也存在相互拮抗性增高趨勢。（2）高表達的c-FLIP可能與TRAIL死亡受體凋亡途徑相互作用，對大腸癌的發生進展起到一定的作用。

[關鍵詞] TRAIL；c-FLIP；凋亡；結直腸癌；淋巴結轉移

[中圖分類號] R735.3+4 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-10-04

結直腸癌是全世界臨床上最常見惡性腫瘤之一，近年來發病率呈明顯的上升趨勢，其術后浸潤轉移及局部復發是結直腸癌患者死亡的主要原因，預后極差，5年生存率低[1-2]。結直腸癌的發生進展需要眾多分子機制的參與，結直腸細胞的不穩定性、異常延長存活時間和最終惡變，與細胞凋亡機制密切相關。

TRAIL（TNF相關凋亡誘導配體），是TNF家族成員之一，可強烈選擇性誘導和促進多種腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無明顯促凋亡作用，是很有前景的抗腫瘤因子之一。c-Flip全稱為細胞型Fas相關的死亡區域蛋白樣白介素-1轉換酶抑制蛋白，可強效抑制TRAIL-Rs和TNF-R1等死亡受體誘導的細胞凋亡，從而阻斷細胞發生凋亡[3-4]。目前有關于TRAIL和c-FLIP在結直腸癌中相互作用的研究鮮有報道，本研究采用免疫組化方法和Western blot對兩者在結直腸癌及轉移淋巴結中的表達情況進行研究，以初步探討兩者在結直腸癌中相互關系及意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集汕大附一醫院2010～2011年手術切除大腸腺癌標本85例，配對選取距癌5 cm外正常組織相同例數，所得標本均經病理學確診。其中男49例，女36例，年齡21～92歲，所有患者術前未行任何治療。85例大腸腺癌中，51例發生淋巴結轉移，未/低分化腺癌31例，中高分化腺癌54例。所有標本分為兩部分，一份立即置于-80℃冰箱保存，標本收集后進行Western blot檢測；另一份制成常規病理標本。

1.2 方法

免疫組化：采用MaxVision-（TM）即用型快捷免疫組化一步法，兔抗人TRAIL多克隆IgG抗體、兔抗人c-FLIP多克隆IgG抗體和免疫組織化學染色試劑盒均購于上海博奧深生物技術有限公司；一抗TRAIL以1︰100、c-FLIP以1︰120稀釋，均以已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照，DAB（聚合物法）顯色。

Western blot：Western blot相關試劑、ECL顯影液購于上海博奧深公司，內參β-actin及相應二抗購自美國Santa公司。一抗TRAIL以1︰120、c-FLIP以1︰150稀釋，ECL顯色拍片。

1.3 結果判斷標準

免疫組化染色切片采用電子光學顯微鏡進行觀察，隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，由兩名專業病理醫師讀片，TRAIL主要表達定位于細胞質和細胞膜，c-Flip主要定位于細胞質。判斷標準均使用FDA推薦的Hercept Test6評分方法：（-）為無細胞染色或<30%的腫瘤細胞細胞膜或質較弱染色；（+）為≥30%的腫瘤細胞細胞膜或質部分較弱染色；（++）為≥30%的腫瘤細胞細胞膜或質完全較弱到中等染色；（+++）為≥30%的腫瘤細胞細胞膜或質完全強染色。

1.4 統計學處理

每組實驗均重復3次。統計學分析采用SPSS16.0軟件進行數據分析，計數資料組間比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman法。檢驗標準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRAIL和c-FLIP在結直腸癌組織中的定位及表達

TRAIL在結直腸癌組織中的定位及表達位于細胞膜及細胞漿，而c-FLIP主要位于細胞漿。見圖1、2，表1。

2.2 Western blot檢測TRAIL、c-FLIP蛋白的基礎表達

在85例大腸癌組織中，免疫組化實驗提示，在正常組織中，TRAIL存在廣泛表達，TRAIL在癌組表達78.9%（67/85）、轉移淋巴組陽性表達74.5%（38/51）與正常組表達65%（55/85）比較，三者均差異無統計學意義（P>0.05）；癌組中，未/低分化陽性表達71%（22/31）與中高分化64.8%（35/54）比較、無淋巴轉移70.6%（24/34）與淋巴轉移64.7%

（33/51）比較差異無統計學意義（P>0.05）；蛋白OD值檢測TRAIL在癌組、LNM組表達量分別為1.455、1.413，較正常組（0.709）增高，且分化程度越低，TRAIL蛋白定量越高。免疫檢測在正常組織中，c-FLIP基本不表達或低表達。c-FLIP在癌組陽性表達95.3%（81/85）明顯高于正常組（15.3%（13/85）且無一例強染色）；其癌組中未發生淋巴轉移陽性表達88.2%（30/34）、淋巴轉移100%（51/51）、低分化和高中高分化分別為96.8%（30/31）、94.4%（51/54），81例陽性表達中強陽性74%（60/81）；LNM組陽性表達100%（51/51）亦明顯高于正常組，其強陽性表達88.2%（45/51），與癌組比較差異無統計學意義（P>0.05）。Western blot檢測c-FLIP蛋白OD值提示c-FLIP蛋白在癌組（2.176）與LNM組（2.089）均存在過表達，均顯著高于正常組（0.339），未/低分化腺癌較中高分化組表達更高，但癌組與淋巴結組表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3、4。

2.3 TRAIL和c-FLIP表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

TRAIL、c-FLIP的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤層次均無相關性，但兩者的表達與淋巴結浸潤轉移、分化程度及臨床TNM分期差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

細胞凋亡是所有多細胞生物常見的程序化死亡過程，是多細胞生物的生存發育和維持內穩態所必須的。不少研究認為，凋亡系統在結直腸腫瘤的發生轉移扮演重要角色，TRAIL死亡受體轉導的細胞凋亡（即外源性凋亡途徑），與腫瘤的發生發展密切相關[5-7]。TRAIL能與相關受體TRAIL-Rs（DR4/TRAIL-R1、DR5/TRAIL-R2）結合以誘導激活凋亡信號殺死腫瘤細胞，TRAIL能特異性地作用于轉化細胞、腫瘤細胞和病毒感染細胞，而對正常組織細胞沒有殺傷作用[8]。其凋亡機制可能為：TRAIL與腫瘤細胞膜上死亡受體DR4、DR5結合，受體內死亡域DD與Fas相關死亡結構域FADD結合形成死亡誘導信號復合物DISC，DISC招募下游procaspase-8，10與之結合后激活caspase-8，進而激發caspases發生級聯反應，從而誘導細胞調亡[9-12]。正常細胞對TRAIL凋亡機制不敏感，其主要原因是正常細胞通過NF-κB介導、誘騙受體及c-FLIP調節來逃逸TRAIL誘導的凋亡。TRAIL作為一種具有明顯促腫瘤細胞凋亡活性的選擇性對抗腫瘤生長的細胞因子，可見其抗腫瘤作用也具有重要意義[13-15]。本實驗結果顯示TRAIL蛋白水平在腺癌及轉移淋巴結中表達較正常組織增高，且分化越低表達量更高，提示可能緣于腫瘤刺激，TRAIL反應性表達增高，以增強TRAIL介導死亡受體凋亡系統在結直腸腺癌的殺傷作用。

然而，目前眾多體內及體外細胞研究發現，不少類型腫瘤對TRAIL介導的凋亡途徑均存在不同程度的抵抗，這主要與該通路下游的c-FLIP的調亡抑制作用密切相關。有研究認為，c-FLIP在黑素瘤、胃癌、霍奇金淋巴瘤等多種人類腫瘤中均呈過表達狀態，而對應的正常組織或良性病變中c-FLIP不表達或低表達，高表達的c-FLIP抑制caspase-8激活從而抑制凋亡，使腫瘤細胞產生凋亡抵抗[8-10]。故提示：作為抑制凋亡因子c-FLIP，其過表達可能競爭性結合腺癌細胞的DISC，抑制caspase-8的活化，阻斷TRAIL介導的死亡受體凋亡途徑，導致正常細胞腫瘤化和腫瘤細胞進一步發展，從而起促腫瘤進展作用。本實驗中c-FLIP在正常結直腸細胞少量/不表達，而在結直腸腺癌顯著過表達，提示在結直腸腺癌中c-FLIP亦存在過表達現象，與上訴研究結果一致。在85例大腸癌中，c-FLIP在結直腸癌組織和轉移淋巴結中存在過高表達，在正常組織低表達或不表達，而TRAIL在癌組織和轉移淋巴結組織也存在相互拮抗性增高趨勢。未/低分化腺癌細胞c-FLIP表達較中高分化更高，提示其與腫瘤分期，分化密切相關，c-FLIP的過表達表明分期越晚，預后越差。

另外，本實驗發現c-FLIP在腺癌與轉移淋巴結表達兩者無明顯差異，故尚未能明確提示其參與腫瘤轉移免疫逃避和腫瘤浸潤轉移機制中有促進作用。c-FLIP在大腸癌細胞及轉移淋巴結組織中存在顯著高表達，能否促進腫瘤細胞浸潤轉移，目前還沒有得到證實，且目前缺少相關實驗研究，有待進一步實驗證實。

4 結論

本研究通過檢測TRAIL和c-FLIP蛋白在結直腸癌組織中的表達情況來推測其可能相互作用關系，并判斷是否與預后有關。在85例大腸癌中，c-FLIP在結直腸癌組織和轉移淋巴結中存在過高表達，在正常組織低表達或不表達，而TRAIL在癌組織和轉移淋巴結組織也存在相互拮抗性增高趨勢。高表達的c-FLIP可能與TRAIL死亡受體凋亡途徑相互作用，對大腸癌的發生進展起到一定的作用。表明c-FLIP可能能夠預測結直腸癌預后，可能成為結直腸癌預后參照重要指標之一。同時c-FLIP和TRAIL也可作為新的潛在治療靶點，進而有效降低腫瘤生物學惡性程度，提高患者生活質量及提高5年生存率，具有臨床前景，但需進一步研究，為臨床相關靶點治療提供依據。

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（收稿日期：2013-04-12）