二至百合濃縮膏對去勢雌性大鼠焦慮行為學的影響

[摘要] 目的 探討二至百合濃縮膏對去勢雌性大鼠（雙側卵巢切除術）焦慮行為學的影響。 方法 3～4月齡Wistar雌性大鼠隨機分成5組，假手術對照組，模型組，二至百合高、中、低劑量組。除假手術組，其余用手術摘除雙側卵巢建立去勢更年期大鼠模型，給藥組分別給予二至百合濃縮膏水溶液（1.92、0.96、0.48 g/kg），假手術空白對照組和模型對照組給予相應容量的蒸餾水，連續45 d。采用高架十字迷宮和明暗箱實驗，觀察實驗大鼠行為學的變化。 結果 二至百合高劑量組可顯著減低模型大鼠高架十字迷宮實驗中OT%，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。二至百合高、中劑量組亦可顯著升高大鼠明箱停留時間和穿箱次數，與模型組比較差異有統計學意義（均P<0.05）。 結論 二至百合濃縮膏具有較好的改善去勢雌性模型大鼠焦慮癥狀的作用。

[關鍵詞] 二至百合濃縮膏；抗焦慮；雌性大鼠；去勢；高架十字迷宮；明暗箱

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-20-03

更年期綜合征是婦女在這一時期由于雌激素水平下降所致的以機體內分泌失調、植物神經系統功能紊亂為主，伴有神經心理癥狀的一組癥候群。二至百合組方中包含女貞子、旱蓮草、百合、知母、牡蠣等中藥組成成分，具有滋陰潛陽，退熱安神之功效。主要用于婦女更年期初期，證見陰虛陽亢，陰虛發熱，骨蒸潮熱，焦慮煩躁，失眠多夢者。本實驗通過雌性大鼠雙側卵巢祛除術復制大鼠更年期綜合征模型，觀察二至百合方對模型大鼠焦慮行為學指標的影響，初步評價藥物的改善更年期焦慮作用。

1 資料與方法

1.1 藥品及試劑

二至百合濃縮膏，北京中研同仁堂醫藥研發有限公司（批號20120902）。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，75只，雌性，體重（200±20）g，SPF級，購自中國人民解放軍軍事科學院實驗動物中心。許可證編號：SCXK-（軍）2007-004。

1.3 儀器

海爾BCD-257SL冷藏冷凍冰箱：青島海爾股份有限公司；Sartorious BT 124S電子精密天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；明暗穿梭箱、高架十字迷宮、高架十字迷宮實驗視頻分析系統、SLY-ETS小動物行為活動記錄分析系統，均由北京碩林苑科技有限公司生產。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備與分組 在適應性飼養5 d后，將75只大鼠隨機分為5組，分別為：假手術空白組，模型組，二至百合高劑量（1.92 g濃縮膏/kg）、中劑量（0.96 g濃縮膏/kg）、低劑量（0.48 g濃縮膏/kg）組，每組15只。

模型組及受試樣品3個劑量組制備雌性去勢大鼠（雙側卵巢切除術）模型[1-2]：大鼠0.1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g體重（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉大鼠取俯臥位，在背部中1/3處剪毛、備皮，碘伏常規消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約2～3 cm，切開皮膚，沿肩胛線分別于左右兩肋下剪開腰肌，暴露出卵巢及緊密相連的子宮，在子宮角上做兩個結扎，結扎后切斷，將卵巢摘除，縫合皮膚。術后連續腹腔注射72萬U/kg青霉素，以防感染，1次/d，連續3 d。術后第3天開始給大鼠陰道涂片觀察，連續5 d，每天1次，以確定卵巢完全切除。實驗動物從術后的第5天起全部進入動情間期，但動物不再出現動情前期，動情期的雌激素變化，動物基本上符合“更年期”表現。假手術空白組大鼠除不行卵巢摘除外，其余步驟同模型組。

造模后9 d，除假手術空白組和模型組給予等體積蒸餾水外，其余各組開始灌胃給藥，每日1次，連續45 d后分別進行高架十字迷宮和明暗箱行為學實驗測試（先開展高架十字迷宮實驗，其后間隔1周后開展明暗箱實驗）。

1.4.2 大鼠高架十字迷宮實驗 末次給藥30 min后，進行高架十字迷宮行為學的測評。實驗開始時，將大鼠放入高架十字迷宮中央，頭朝開臂，觀察5 min內大鼠的活動情況[3-5]。觀察并記錄以下各項指標：進入開臂次數，進入閉臂次數，以及在兩臂的滯留時間。分別計算大鼠進入開臂的時間占總時間（開臂和閉臂滯留的時間之和）的百分比（open arm time percent，OT%），以及大鼠進入開臂的次數占總次數（開臂與閉臂之和）的百分比（open arm entry percent，OE%）。觀察時以大鼠四爪均進入開臂或閉臂為準。

1.4.3 大鼠明暗箱實驗 末次給藥30 min后，將大鼠置于明箱中央，背朝通道，觀察5 min內大鼠的活動情況并記錄明暗箱停留時間和穿箱次數。

以上兩種行為學檢測實驗操作時，應保持外界環境安靜，每次放入大鼠前清理干凈箱內的排泄物，盡可能保證每批次檢測的客觀性。

1.5 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行統計處理，數據以（）表示，數據先進行方差齊性檢驗。方差齊選用One-Way ANOVA法進行各組間比較；方差不齊選用t檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 二至百合濃縮膏對去勢大鼠高架十字迷宮行為活動的影響

實驗結果顯示，模型組組大鼠與假手術空白組比較，OE%和OT%顯著減小（均P<0.01），表現出明顯的焦慮癥狀。二至百合高劑量組可顯著減低模型大鼠OT%，與模型組組比較差異有統計學意義（P<0.05）。表明受試品具有較好的改善去勢雌性模型大鼠高架十字迷宮焦慮癥狀的作用。見表1。

2.2 二至百合濃縮膏對去勢大鼠明暗箱穿梭行為的影響

研究結果顯示，模型組大鼠明箱停留時間和穿箱次數均顯著降低，與假手術空白組比較差異有統計學意義（分別P<0.001， P<0.05），表明模型組大鼠去勢后，產生了明顯的焦慮行為改變。與模型組比較，二至百合高劑量組可顯著升高大鼠明箱停留時間和穿箱次數（分別P<0.001，P<0.01），中劑量組可顯著升高大鼠明箱停留時間和穿箱次數（均P<0.05）。見表2。

3 討論

更年期綜合征[6]屬于中醫學“絕經前后諸癥”范疇，歷代文獻關于本病的論述散見于“臟躁”“心悸”“失眠”“眩暈”“頭痛”“郁證”等病癥中。絕經前后腎臟虛損，腎氣漸衰，陰精耗傷，陰陽平衡失調，臟腑功能紊亂而出現絕經前后諸癥證候[7]。隨著我國人口結構不斷老齡化和社會競爭日益激烈，不良的工作環境、家庭關系緊張及精神等因素影響，婦女進入更年期逐漸增加、年齡提早，從而使更年期焦慮癥的發病率亦明顯增加[8]。因此治療和緩解更年期綜合征焦慮癥具有重要的社會意義。

二至百合方由經典方劑“二至丸”和“百合知母湯”合方加減而成，具有滋陰潛陽，退熱安神之功效。本研究主要通過雌性大鼠卵巢祛除術復制大鼠更年期綜合征模型，進而采用高架十字迷宮和明暗箱實驗觀察二至百合方對模型大鼠焦慮行為學的影響，評價處方的改善更年期綜合征焦慮作用。

高架十字迷宮模型，為抗焦慮研究中公認的非條件反射模型，是抗焦慮研究中應用最廣泛的模型之一[9]。它利用動物對新異環境的探究特性相對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾行為，進入開放臂的百分數（OE%）和在開放臂停留時間的百分數（OT%）反映的是動物趨近規避沖突的結果，與焦慮程度直接相關。通常抗焦慮藥只增加動物對開放臂的探索，使OE%和OT%上升。開放臂和封閉臂總進入次數反映了動物總的運動能力，可用來觀察藥物有無鎮靜作用及鎮靜強度。被保護區的活動性一定程度上與抗焦慮劑的效應相關[10]焦慮動物的OE%和OT%明顯降低，經典抗焦慮藥物則使兩者升高[11]；明暗箱行為實驗[12-13]中，明箱活動時間越長，探洞和穿梭次數越多，反映實驗動物對新環境的探索欲望水平越高，探索欲越強則代表環境適應能力越強，焦慮水平越低。

本實驗以去勢大鼠造成更年期模型，考慮動物行為檢測的個體差異可能比較大，所以本實驗選用了較為經典的2種焦慮行為檢測方法進行二至百合膠囊的抗焦慮實驗。本研究表明，高架十字迷宮實驗中，與假手術空白組比較，去勢大鼠進入開閉時間和次數的百分率顯著下降，在明暗箱實驗中，與假手術空白對照組比較，去勢大鼠在明箱停留時間明顯縮短，穿箱次數明顯減少。由此提示，去勢動物處于焦慮狀態。高架十字迷宮實驗中，二至百合濃縮膏3個劑量組均可增加去勢大鼠OE%和OT%值，與模型組比較，中劑量組OE%和OT%值有明顯的統計學意義（P<0.05），高劑量組的OT%值與模型組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。低劑量組的OE%和OT%值與模型組比較有增加，但無顯著性差異。實驗結果表明二至百合濃縮膏有一定的抗焦慮作用。明暗箱實驗中，二至百合濃縮膏高、中劑量組大鼠的明箱停留時間和穿箱次數與模型組大鼠相比均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。兩個實驗結果表明，二至百合濃縮膏在大鼠高架十字迷宮和明暗箱行為學測試中均表現出較好的抗焦慮作用，表明受試品具有較好的改善去勢雌性模型大鼠焦慮癥狀的效應。

根據相關文獻報道含有百合[14-15]、知母[16-17]等藥物組方在臨床上對更年期綜合征具有明顯治療作用，有實驗表明含有女貞子[18]的復方藥物連續灌胃可明顯降低更年期大鼠血清促性腺激素FSH含量，對血清E2含量有顯著增加作用，使更年期陰虛內熱、煩躁不安、失眠等癥狀得以緩解。

本實驗研究結果表明二至百合方對更年期焦慮癥狀有明顯改善，對更年期綜合征有一定的緩解作用，但是二至百合方改善更年期綜合征模型大鼠焦慮行為學的作用機理有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2013-04-28）