大鼠急性脊髓損傷后Bak基因的表達及其意義

[摘要] 目的 探討Bak基因在大鼠急性脊髓損傷（ASCI）中的表達及其意義。 方法 選取64只SD大鼠隨機分為模型及對照兩組，每組32只，模型組以改良Allen's法制作SD大鼠急性脊髓損傷動物模型，對照組只行椎板切開不損傷脊髓。分別于傷后3 h、1、3、7 d時（每個時間點8只）應用改良Tarlov評分法評價其神經功能；然后處死動物，取受損節段脊髓行HE染色及免疫組化染色，觀察形態學改變和Bak基因表達的特點；并應用TUNEL方法檢測神經細胞凋亡情況。其量的評定借助于麥克奧迪數碼醫學圖像分析系統A（Motic.med 6.0）軟件，結果分別用累積光密度及細胞凋亡指數來表示。 結果 對照組大鼠下肢功能均無明顯癱瘓，模型組大鼠下肢均出現不同程度功能障礙，對照組各時間點的Tarlov評分均高于實驗組（P<0.05）。對照組各時間點脊髓組織未見明顯出血、水腫和細胞凋亡壞死，模型組各時間點脊髓組織均有不同程度出血、水腫、細胞凋亡及壞死。對照組未見明顯Bak基因表達，模型組各時間點Bak基因表達均明顯高于對照組（P<0.05），模型組內Bak基因表達3 h點出現，1 d增加，3 d達高峰，7 d明顯減少。模型組內細胞凋亡3 h點少量出現，1 d增加，3 d達高峰，7 d明顯減少。 結論 脊髓損傷激活Bak基因表達，從而誘導神經細胞凋亡，可能為其病情進展的重要機制之一。

[關鍵詞] 脊髓損傷；Bak基因；細胞凋亡；Bcl-2家族

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-26-04

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）包括原發性和繼發性兩種形態，以后者最為多見，多由急性外傷引發。隨著現代機械產業和交通運輸的發展，其發病率在世界范圍內逐年升高，為目前全球性醫學研究熱點之一[1-2]。研究結果顯示，脊髓損傷可累及感覺、運動、反射等多項生理功能；臨床表現為組織水腫、缺血、細胞壞死等，其中，神經細胞凋亡為其繼

發性功能退變的主要機制。Bak基因為Bcl-2同源類似物，可介導Bcl-2的凋亡抑制效應，具有促凋亡樣作用。臨床癌癥研究結果顯示[3-4]，Bal-xl/Bak表達異常，可介導癌細胞的增生或凋亡過程，影響患者的病情進展和預后轉歸。近年研究表明，Bcl-2家族在脊髓損傷的發病過程中，發揮了重用作用，其中Bcl-2低表達為脊髓神經細胞大量凋亡的重用觸發因素之一。本研究以急性脊髓損傷大鼠模型的Bak表達情況與神經細胞凋亡的關系為切入點，探討Bak基因在大鼠急性脊髓損傷（ASCI）中的表達及其意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組 健康SPF級SD大鼠64只（由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供），雌雄各半；月齡3～3.5個月，平均（3.2±0.6）個月；體重205～240 g，平均（221.0±17.3）g。隨機分為模型組和對照組各32只，適應性飼養3～5 d；飼養環境：溫度21～25℃，濕度55%～65%。

1.1.2 主要儀器 Allen's撞擊器（采用不銹鋼自行制備）；全自動石蠟切片機（ERM4000，常州市郝思琳醫用儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（WD841-1，吳江萬達電熱設備有限公司）；超低溫冰箱（DW-86L205，廣州傲雪制冷設備有限公司）；熒光顯微鏡（CYG-055D，麥克奧迪）等。

1.1.3 主要試劑 青霉素注射液（山東魯抗醫藥股份有限公司）；慶大霉素注射液（山東魯抗醫藥股份有限公司）；HE染色液試劑盒（上海億欣生物有限公司）；TUNEL試劑盒（南京凱基）；Bax一抗（abcam）；Bax二抗（abcam）；其他試劑如二甲苯、蔗糖、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠脊髓損傷模型的制備方法 模型組以改良Allen's法制備脊髓損傷大鼠模型，對照組行椎板切開，不損傷脊髓。制備方法：（1）1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于解剖板；（2）以浮肋與13胸椎連接處為基準點，在5 cm2范圍內脫毛，顯露光滑皮膚組織；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中線2～3 cm做縱行切口，依次切開皮膚、筋膜，可見白色腱膜；（4）借助剝離分針鈍性剝離椎旁肌肉叢，可暴露棘突、椎板和橫突；（5）定位并標記T10胸椎，在椎體上下中橫向切口，再以兩個縱向切口將其連接成方形結構，并以咬骨鉗去除該骨板，顯露方形骨窗；（6）以自制Allen's撞擊器打擊T10胸椎內側，保持自由落體運動，控制高度約2.5～3.0 cm，每次擊打保持在打擊點停留2～3 min；（7）至脊髓組織出現血腫，硬脊膜呈紫紅色停止擊打，縫合傷口；（8）單籠飼養，青霉素聯合慶大霉素抗感染，并人工輔助排尿，保持墊料清潔，并及時清理傷口分泌物。

1.2.2 大鼠脊髓損傷模型的評價方法 本實驗以組織學病理特征和神經功能評分作為模型評價標準。

1.2.2.1 神經細胞形態學觀察方法 （1）1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，行4%多聚甲醛心臟灌流，灌流前以生理鹽水沖凈循環系統血液，至臟器白化后方可滴注多聚甲醛；（2）取T9～T11椎體之間所有脊髓組織，浸泡于4%多聚甲醛12～24 h，以常規蔗糖梯度脫水法脫水，石蠟包埋；（3）包埋后石蠟塊可于-70℃超低溫冰箱保存，使用時以恒冷箱切片機切成15μm切片，常規HE染色，觀察組織形態。

1.2.2.2 神經功能評定方法 按照改良Tarlov標準，見表1；采用雙盲法，由2位觀察人員打分，每只大鼠觀察5次，每次5 min，記錄總分，取平均值。

1.2.3 Bak基因表達測定方法 采取常規免疫組化染色法測定石蠟切片Bak基因表達，一抗和二抗濃度分別為0.5%、1%，封片后熒光顯微鏡觀察，并以麥克奧迪數碼醫學圖像分析系統進行光密度測定。

1.2.4 神經細胞凋亡指數測定方法 按TUNEL試劑盒說明書操作：（1）石蠟切片常規脫蠟至水，先后經蛋白酶K、3% H2O2、甲醇處理，小牛血清封閉；（2）混勻TUNEL反應液，滴于玻片組織面，恒溫箱孵育，37℃，1 h；（3）熒光顯微鏡檢測，并以麥克奧迪數碼醫學圖像分析系統進行細胞計數，在高倍光鏡下，選取5個視野，計算神經細胞指數，取平均值。

1.3 統計學處理

所有數據均以統計學軟件SPSS17.0進行分析；計量資料以（）表示，行t檢驗；計數資料以率或構成比表示，行x2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型制備結果

本組大鼠共制備模型32只，2例死亡，其他大鼠均全部存活，模型制備結果如下。

2.1.1 病理切片形態學變化 病理切片顯微觀察結果顯示，模型組大鼠各時間點脊髓組織均有不同程度血腫和壞死；而對照組大鼠無明顯變化。

2.1.2 神經功能評分比較 對照組大鼠下肢功能基本處于正常狀態，而模型組表現出不同程度功能障礙，其Tarlov評分顯著低于對照組（P<0.01）。見表2。

2.2 Bak基因表達結果

對照組未見明顯Bak基因表達，模型組Bak基因表達于術后3 h點出現，1 d增加，3 d達高峰，7 d明顯減少；其各時間點Bak基因表達均明顯高于對照組（P<0.05）；見表3、圖1。

2.3 神經細胞凋亡指數

對照組未見明顯神經細胞凋亡，模型組神經細胞凋亡于術后3 h點出現，1 d增加，3 d達高峰，7 d明顯減少；其各時間點神經細胞凋亡指數表達均明顯高于對照組（P<0.01）；見表4、圖2。

3 討論

SCI可分為原發性和繼發性兩大類，前者是指脊髓組織受直接機械外力作用而發生的實質性損傷；后者則是指脊髓組織受損后的繼發性病理改變，以神經元受損和神經細胞凋亡為主要微觀特征，表現出組織水腫、微循環障礙、缺血性壞死、及繼發性炎癥等一系列病理征象。本組實驗以改良Allen's法制備脊髓損傷大鼠模型，重在研究其脊髓受創后的繼發性病理變化以及在這一變化中Bak基因與神經細胞凋亡的相關性；根據本實驗研究結果，分述如下。

3.1 模型的制備

本實驗以Allen's打擊法制備大鼠脊髓損傷模型，采取自制不銹鋼Allen's撞擊器。長度大于創面，并以刻度標記，方便根據軸點計算不同擊打高度的擊打力度。本組實驗選取擊打高度2～3 cm，擊打重量約為120～180 g。其基本理論依據為以一定力量撞擊脊髓，造成突發性機械力損傷；伴隨擊打次數增多，出現血腫、組織壞死等病理表現，最大限度的模仿或接近人類骨髓損傷的病理反應態[5]。目前，相關脊髓損傷模型的研究，多以胸段脊髓為對象；根據國內外研究現狀，結合臨床實踐，本實驗選取T10胸椎體，主要基于以下考慮：（1）與臨床病例收入情況保持一致。胸段脊髓損傷為臨床患者最常見部位，因此，本實驗首要定位為胸椎。（2）從大鼠解剖結構而言，T10部位解剖、定位操作比較簡單，相應簡化了手術難度，可保證定位的準確性及手術成功率。

模型評價結果顯示，模型組大鼠各時間點脊髓組織均有不同程度血腫和壞死；而對照組大鼠無明顯變化。對照組大鼠下肢功能基本處于正常狀態，而模型組表現出不同程度功能障礙，其Tarlov評分顯著低于對照組（P<0.01）。提示模型組大鼠可表現出脊髓損傷的典型特征，本實驗模型制備基本成功。

3.2 Bak基因表達與細胞凋亡的關系

近年研究表明，SCI的最終損傷程度取決于細胞凋亡的最終狀態；而細胞凋亡為脊髓損傷后的繼發性進展，以局部神經生長因子缺乏、促凋亡因子激活等因素密切相關[6-7]。

Bcl-2和Bax分別為細胞凋亡抑制因子和促凋亡因子，研究表明[8]，Bcl-2在細胞凋亡調控中發揮重要作用，抑制多種因素或因子誘發的細胞凋亡，發揮凋亡抑制作用。Bcl-2主要存在于細胞線粒體，屬于細胞凋亡的原癌基因之一，可在不影響細胞周期和分化的基礎上抑制細胞凋亡、延長細胞壽命[9]。其作用機制尚未完全闡明，可能與以下因素有關[10]：（1）減少氧自由基產生和脂質過氧化物形成，起到抗氧化應激性損傷樣作用；（2）抑制凋亡信號的細胞間傳導，防止凋亡反應激活；（3）與其他促凋亡因子結合，抑制其活性。Bax的高表達對Bcl-2有抑制作用，從某種意義上講，Bcl-2/Bax的活性狀態最終決定了細胞的存活/凋亡狀態。作為Bax誘導細胞凋亡的輔助分子，Bak在近年的研究中日益受到重視。

目前研究已證實，促凋亡基因Bak可介導多種細胞的凋亡反應[11-12]。李紅等[11]研究表明Bak干擾RNA可阻斷人體顆粒細胞凋亡過程，從而起到延緩衰老的作用。陳廣生等研究表明，Bak可參與人體大多數星形細胞瘤地凋亡過程，其作用力度在高分化的星形細胞瘤中顯著高于低分化細胞。在癌癥領域的研究中，亦有類似報道，包括乳腺癌、肝癌、肺癌等多種組織和多個系統[13-14]。在脊髓損傷的研究中，已證實Bcl-2系統的廣泛性參與，而相關Bak的獨立研究較為鮮見，其介導脊髓損傷的具體機制尚未完全明確[15]。本研究分析其可能與Bak對Bax的協調作用有關，而Bax是否可以發揮單獨作用尚需深入研究。

綜上所述，脊髓損傷的過程，呈以細胞凋亡為主的進行性進展態。在損傷后各時段，細胞凋亡指數與Bak呈現出一致的變化規律，即先增加后減少的典型特征。提示急性脊髓損傷激活Bak基因表達，從而誘導神經細胞凋亡，可能為其病情進展的重要機制之一。

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（收稿日期：2013-04-22）