4種煎煮方法下大黃中沒食子酸含量及小腸推進作用比較研究

[摘要]目的 探討不同煎煮時間下大黃水煎液中沒食子酸的含量及對小鼠小腸推進作用。 方法 采用HPLC法測定水煎液中沒食子酸的含量，采用墨汁推進度試驗考察它們對小鼠小腸的推進作用。 結果 煎煮時間越長，沒食子酸含量越高；與空白對照組相比，生大黃煎煮15 min及25 min的水煎液對小鼠小腸推進作用顯著（P<0.05），生大黃煎煮35及45 min的水煎液對小腸無顯著推進作用。 結論 大黃水煎液中沒食子酸含量越高，其對小鼠小腸的推進作用越弱；生大黃煎煮15～25 min的水煎液對小鼠小腸推進作用最好。

[關鍵詞]大黃；煎煮；沒食子酸含量；小腸推進作用

[中圖分類號] R283.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-46-03

大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，具有瀉下攻積，清熱瀉火，逐瘀通經等功效。大黃中主要化學成分有鞣質類成分、雙蒽酮類成分及游離、結合型蒽醌類成分[1]等。生大黃瀉下作用峻烈，其中鞣質類代表性成分為沒食子酸（gallic acid），具有止血收斂等多種藥理活性[2-3]。本研究首先制備4種不同的生大黃水煎液，并采用HPLC法測定各水煎液中沒食子酸的含量，然后用墨汁推進度試驗考察它們對小鼠小腸的推進作用，以期為大黃的臨床合理應用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Water's高效液相色譜系統；AUW220D電子分析天平（日本島津公司）；UPT優普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

藥品及試劑：生大黃（購自湖北天濟中藥飲片公司）；沒食子酸標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200803）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），其他試劑均為國產分析純，試驗用水為超純水。

試驗動物：清潔級昆明種小鼠，共30只，8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，購自華中科技大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2010-0009，編號：2013-006。

2 方法與結果

2.1 生大黃水煎液的制備方法[4]

取適量水，加熱煮沸后備用。再取等量的生大黃藥材4份，各自稱重后，分別加藥材量3倍量的沸水，分別繼續煎煮15、25、35、45 min，趁熱過濾后留存濾液。將上述水煎液分別用適量水定容至50 mL容量瓶中，使其含量均為含生藥量0.09 g/mL，密閉后，置于干燥陰涼處備用。

2.2 大黃水煎液中沒食子酸的含量測定方法[4-5]

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗 色譜柱：Inertsil ODS-3 C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相：乙腈︰0.1%磷酸=10︰90（v/v），檢測波長：272 nm，柱溫：25℃，流速：0.8 mL/min，進樣量：10μL，樣品室溫度：4℃。理論塔板數按沒食子酸峰計算應不少于3000。在此色譜條件下，樣品及標準品溶液的色譜圖見圖1。

2.2.2 標準品溶液制備 取沒食子酸標準品10 mg，精密稱定后，加甲醇制成質量濃度為100.6 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取各大黃水煎液5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加30 mL甲醇，超聲約40 min后，放冷至室溫，再加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾后取續濾液用微孔濾膜（0.22μm）濾過，即得。

2.2.4 標準曲線制備 精密吸取標準品溶液2.5、5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積A為縱坐標，進樣量ρ為橫坐標，繪制標準曲線，線性方程為：A=1796.45ρ+877.6，沒食子酸在0.25～2.5μg范圍內質量濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

2.2.5 穩定性 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、36 h各進樣10 μL測定，結果峰面積RSD為1.04%，表明供試品溶液在36 h穩定性良好。

2.2.6 精密度 精密吸取標準品溶液10 μL，在同一天內連續進樣測定6次，峰面積RSD為0.87%；精密吸取標準品溶液10 μL，每天測定1次，連續6 d，峰面積RSD為1.76%。日內及日間精密度均小于3%，符合測定要求。

2.2.7 重復性 取同一批的生大黃藥材，共5份，按照“2.1”及“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，測定沒食子酸含量，RSD為1.13%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收 取已知含量的生大黃藥材5份，精密稱定后，各加入標準品溶液1.0 mL，按照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液并測定沒食子酸的含量，平均回收率為100.2%，RSD為0.71%，表明方法準確度高。見表1。

2.2.9 測定方法 精密吸取生大黃水煎液供試品溶液及標準品溶液各10 μL，按上述色譜條件進樣分析，記錄生成產物的峰面積，代入線性方程以計算其含量，并求出各組的平均值以（）表示，采用SPSS19.0軟件，各組間進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義；生大黃水煎液1組分別與其他組進行獨立樣本t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。結果發現，煎煮時間越長，生大黃水煎液中沒食子酸含量越高。見表2。

2.3 小鼠小腸推進作用研究[6-8]

30只小鼠，禁食不禁水24 h后，隨機分為5組，第1組為生理鹽水組，作為空白對照，第2～5組分別對應生大黃水煎液1～4組，每組6只。給藥組按照5 g/kg的劑量灌胃各生大黃水煎液（含50%碳素墨汁）；空白組灌胃相同量的生理鹽水（含50%碳素墨汁）。給藥30 min后，脫頸處死小鼠，打開腹腔，測量墨汁在小腸內的推進距離以及小腸總長度，按照以下公式計算墨汁推進百分率。求出各組的平均值以（）表示，采用SPSS19.0軟件，各組間進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義；第1組分別與其他組進行獨立樣本T檢驗，P<0.05差異有統計學意義。見表3。

3 討論

大黃瀉下活性成分主要為蒽醌類，而發揮收斂止瀉作用的成分主要為為鞣質類單體化合物沒食子酸。朱詩塔等[4]表明：在一定時間內，隨著大黃煎煮時間的延長，其水煎液中蒽醌類化合物含量逐漸增多，瀉下作用越強；之后，隨時間延長，蒽醌含量又呈下降的趨勢，瀉下作用減弱，表現為對小鼠小腸推進作用減弱。但是，鞣質類成分在煎煮過程中的含量如何變化及對鞣質類成分對大黃中蒽醌類成分發揮瀉下作用的影響值得繼續探討。本研究對不同煎煮時間所得生大黃水煎液中沒食子酸的含量以及它們的瀉下作用進行了對比研究。結果發現，煎煮時間越長，生大黃水煎液中沒食子酸的含量越高。與空白對照組相比，生大黃沸水煎煮15 min及25 min的水煎液對小鼠小腸推進作用顯著（P<0.05）；煎煮35 min及45min的水煎液對小腸沒有顯著的推進作用。這說明：大黃水煎液中沒食子酸含量越高，其對小鼠小腸的推進作用呈減弱的趨勢。另外，生大黃沸水煎煮15～25 min時其水煎液對小鼠小腸的推進作用最好。

煎煮時間是中藥煎服時發揮藥效的重要因素之一，對大黃煎煮時間控制不當，僅關注蒽醌類活性成分的瀉下作用卻忽視沒食子酸的止瀉作用，大黃就可能無法發揮良好的通便作用。因此，本研究對不同煎煮時間下生大黃水煎液中沒食子酸的含量變化及其與小腸推進作用的關系進行了對比研究，為大黃的臨床合理用藥提供了一定的科學依據。

[參考文獻]

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[3] 楊欣文，李俊松，吳德康，等.大黃酒炙前后8種成分的含量比較[J].現代中藥研究與實踐，2012，26（3）：73-75.

[4] 朱詩塔，李新中，雷鵬，等.不同煎煮法對大黃沒食子酸含量的影響及與小腸推進作用的相關性[J].中南藥學，2008，6（6）：714-717.

[5] 秦貽強，蔡小玲，龔勛.西帕依固齦液中總鞣質和沒食子酸的含量測定[J].中國醫藥科學，2012，2（5）：97-98.

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[7] 陳曉亮，謝振家，黃美星，等.熱壓大黃與生大黃對通便作用的比較研究[J].中國現代中藥，2009，11（6）：34-36.

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（收稿日期：2013-04-17）