原生質體融合技術在微生物遺傳育種中的應用

摘 要 原生質體融合技術是微生物遺傳育種中的一項重要技術，它具有遺傳信息傳遞量大，不受親緣關系的影響，可有目的地選育理想的融合株，便于操作等優點，在遺傳育種中具有廣闊的應用前景。文章從原生質體融合的特點以及融合技術應用等方面進行了綜述。

關鍵詞 原生質體；原生質體融合；遺傳育種'

原生質體融合就是將兩個親株的細胞壁分別通過酶解作用加以剝除，使其在高滲環境中釋放出只有原生質膜包被著的球狀原生質體。然后將兩個親株的原生質體在高滲條件下混合，由聚乙二醇助融，使它們相互凝集，通過細胞質融合接著發生兩次基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在再生細胞中獲得重組體。

兩個具有不同基因型的細胞，采用適宜的水解酶剝離細胞壁后，在融合劑作用下，兩原生質體接觸，融合成為異核體，經過繁殖復制進一步核融合，形成雜合二倍體，再經過染色體交換產生重組體，達到基因重組的目的，最后對重組體進行生產性能，生理生化和遺傳特性分析。

一、原生質體融合的特點

1.雜交頻率較高

由于原生質體沒有細胞壁的障礙，而且在原生質體融合時加入融合促進劑PEG，所以微生物原生質體間的雜交頻率都明顯高于常規雜交方法。

2.受接合型或致育性的限制較小

由于兩親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利不同種屬間微生物的雜交。另外，出于原生質體融合是和致育性沒有關系的細胞雜交，所以其受接合型或致育性的限制就比較小。

3.重組體種類較多

由于原生質體融合后，兩個親株的整套基因組之間發生相互接觸.有機會發生多次交換，可以產生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組體

二、原生質體融合技術的應用

在微生物育種中，常根據不同需求通過原生質體融合技術培育出優質、高產、抗逆性強等優點的微生物菌種。

1.標記菌株的篩選

用于原生質體融合的親本需要攜帶遺傳標記，以便于重組體的檢出。常用營養缺陷型和抗性作為標記，也可以采用熱致死，孢子顏色，菌落形態作為標記。實際時究竟采用哪種遺傳標記，要根據實驗目的來確定。如果原生質體融合的目的是為了進行遺傳分析，那么應該采用帶有隱性基因的營養缺陷性或抗性菌株；如果從育種角度進行原生質體融合，由于大多數營養缺陷性菌株都會影響代謝產物的產量，所以在選擇營養缺陷性標記時，應盡量避免采用對正常代謝有影響的缺陷性菌株。

2.原生質體融合育種的應用

陳寧等以球形芽抱桿菌和蘇云金芽泡桿菌H4為親株（前者對淡色庫蚊有高毒力，后者對粘蟲、玉米螟有高毒力），在2-3 mg/ml溶菌酶濃度下，42°C酶解45分鐘，獲得了原生質體，其原生質體形成率和再生率分別為91.2%、37.6%及93.3%、31.2%，然后將獲得的原生質體以l：1比例混合，加入40%的PEG于42°C保溫5min，結果獲得了既殺雙翅目又殺鱗翅日幼蟲的融合子。

3.在鏈霉菌原生質體融合育種方面

邢孔照等以巴龍霉素產生菌和新留素產生菌的高產變種營養缺陷型為親株進行融合，產生原養型重組體的頻率為10-4。其中有58%產生巴龍霉素，并從中獲得了產量比原始菌株（300ug/ml）提高5-6倍的融合子。楊昭中等以四環素產生菌金色鏈霉菌和正定霉素產生菌天藍淡紅鏈霉菌正定變種為親株進行融合，以自身抗生素抗性為標記選擇種間融合子，從而獲得了一株正定霉素產量較親株提高了2.6倍的融合子。

4.優化菌發酵特性

許多種微生物能在45-65℃生存，有的甚至更高。有種耐熱菌可在98℃溫泉中生長繁殖。關于微生物耐熱性的機理研究還不是很清楚，但其耐熱性卻有很重要的應用價值。如在酒精釀造中，釀酒酵母于40℃時產酒明顯下降，為此必須消耗大量能源降低發酵液的溫度。因此，將釀酒酵母396（能利用甘蔗糖蜜生產酒精）和假絲酵母C6（45℃生長良好）為親本，進行原生質體融合篩選得到在40℃培養條件下原料利用率為94.3%、乙醇產量為59.7g/L的屬間融合株。

5.菌種遺傳特性的改良

通過原生質體融合技術使兩個菌株的遺傳物質得到重組，從而獲得兼具兩個親本優良性狀的新菌株。如蘇云金桿菌以色列變種產生的殺蟲毒素主要殺死雙翅目昆蟲，而蘇云金桿菌庫斯塔基變種產生的毒素蛋白主要殺鱗翅目昆蟲。將這兩個菌株的原生質體進行融合，篩選得到既殺鱗翅目昆蟲、又殺雙翅目害蟲的重組菌株。

三、問題與展望

原生質體融合技術作為遺傳育種的一個有效手段，已廣泛應用微生物、植物育種中。但是由于融合子的篩選方法對親本菌株要求較高，需要其自身具有或通過人為誘導使其具有某種特征型標記，若能發展出一種更為普遍的篩選方法，則能大大減少對親本菌株的限制。微生物育種工作的各個方面。都只局限于兩個菌之間的融合，沒有擴展到3個以上的菌之間的融合，如果我們能夠開展多個菌之間的融合，則有可能獲得同時具多個優良性狀的菌株，進一步擴寬這一技術的應用。并且原生質體融合技術運用否能成功仍受到客觀因素的影響，這些都有待于我們進一步去研究和解決。如果將原生質體融合技術與代謝工程及各種分析方法相結合，即可闡明表型或代謝途徑得到優化的分子機制，甚至發現代謝網絡中一些未知的調節機制。相信隨著原生質體融合技術的一步應用發展，以及與重組DNA技術、代謝工程及其分析方法等其它生物技術相結合，必將在功能基因組學的研究、揭示基因型和表型的關系以及工業微生物菌種的改進等方面發揮越來越重要的作用。

參考文獻：

[1]林紅雨等.歐文氏菌和棒桿菌的屬間融合研究[J].微生物學通報，1999，（1）.

[2]黎永學等.雙歧桿菌和釀酒酵母原生質體融合子篩選方法的探討[J].食品科學，2006，（2）.

作者簡介：楊其沄，長江大學生命科學學院生物工程系。