NMNAT的結構及其對糖代謝的影響

王大鵬 李 強

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院內分泌代謝病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物體內多種氧化還原反應的重要輔酶，也是許多NAD消耗酶的底物。煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶(NMNAT)是催化NAD生物合成的關鍵酶，它催化這一可逆反應向前進行，對維持體內NAD水平的穩態至關重要。近年來的研究發現，在NMNAT催化下的NAD生物合成水平，不僅對于SIRT1的活性有重要影響，還能在沉默信息調節因子1(SIRT1)介導下改善生物體內的葡萄糖代謝。人們還發現它對于代謝紊亂和衰老情況下胰島β細胞功能紊亂的調節也至關重要。NMNAT在哺乳動物體內的三種亞型有著不同的亞細胞定位及組織分布，且功能各異。

1 NMNAT亞型及結構

已有研究證明，哺乳動物NMNAT存在三種亞型：NMNAT1-3，它們與嚙齒類動物NMNAT的同源異構體之間氨基酸序列的相似性很高。例如人NMNAT-1與小鼠NMNAT-1之間的氨基酸序列有80%左右的同一性；NMNAT-3之間比率相仿；而NMNAT-3同源異構體之間的氨基酸序列同一性竟達99%(小鼠NMNAT多出4個氨基酸)。人NMNAT亞型之間結構各異，亞細胞定位不同，且存在于各自的染色體，由各自的基因編碼。每一個種屬的哺乳動物NMNAT都有其特異性且具有親和力的二價陽離子。NMNATs也分別作用于不同底物：ITP、GTP、或其他嘌呤核苷酸底物的類似物。

有研究認為其亞細胞定位是受功能特異性靶向作用區域(ISTIDs)調控，ISTIDs由單一外顯子編碼，這一控制區在低級別生命體中并不存在，而且其與NMNAT的酶促反應無關。ISTIDs含有棕櫚?；⒘姿峄确g后修飾位點，可以調節細胞內NAD池區域的劃分。

人NMNAT-1是一種同源六聚體結構，其亞單位分子量為32 kD。在體內含量最為豐富，表達也最為廣泛。編碼它的基因定位于染色體(1p32-35)，它含有279個氨基酸殘基，前四個氨基酸組成無序的羧基端。人NMNAT-1含有谷氨酸107—賴氨酸146的亞型高度特異性序列，由單一的亞型特異的外顯子編碼，該序列中包含了人NMNAT-1的細胞核定位信號以及調節人NMNAT-1—PARP-1反應過程的磷酸化區域，所以人NMNAT-1僅定位于細胞核。

人NMNAT-2在中樞神經組織中含量豐富，心臟和骨骼肌中也有表達，其基因定位于(1q25)，與NMNAT-1的基因序列同一性僅為34%～35%，但也含有四個氨基酸組成的無序羧基端。它共擁有307個氨基酸殘基，內部含有由三個外顯子編碼的亞型特異性序列：賴氨酸107—亮氨酸192。其整體氨基酸序列根據功能結構不同大致可分四個區域：喜入區：232個氨基酸殘基；準入區：29個氨基酸殘基；易入區：1個氨基酸殘基；禁入區：2個氨基酸殘基。NMNAT-2是亞單位分子量為34千道爾頓的二聚體結構。其性質不穩定，易于氧化，在神經細胞內半衰期<2 h。因為其表面形成一種亞型特異性“外衣”，所以易被棕櫚酰化并貼附于高爾基復合體。

人NMNAT-3是一種同源四聚體結構，分子量28 kD，含有252個氨基酸殘基，內部亞型特異性序列為亮氨酸105—丙氨酸125，無序羧基端與前兩者相同，其N端的氨基酸序列決定了其線粒體定位。NMNAT-3的表達形式與NMNAT-2幾乎不重疊，含量明顯少于NMNAT-1。人體肺臟、脾臟、紅細胞中都有NMNAT-3的表達，在胎盤及腎臟中也有小范圍的組織分布〔1～4〕。

2 NMNAT的生物作用

2.1NMNAT的NAD合成活性 NAD是生物體內重要的攜電子體和信號通路中的重要分子，它是生物體內氧化還原反應的重要輔酶，這早已被人們所熟知。但其在生物體內所發揮的作用還遠不止這一種。人體內許多NAD消耗酶都要以其為底物，例如：ADP核糖轉移酶、ADP核糖聚合酶、cADP核糖聚合酶以及去乙?；傅取Ｔ缫延醒芯孔C明，NAD除在氧化磷酸化和氧化還原反應中發揮其經典作用外，還在基因轉錄、生命延長及細胞死亡過程中起調節作用，更在糖代謝及生理節律的控制中發揮調節功能〔5,6〕。NMNAT是體內NAD生物合成過程中的關鍵酶，對于維持體內NAD水平至關重要。原核生物和一些低級別的真核生物體內的NAD是由煙酸經從頭合成途徑合成，而哺乳動物體內NAD主要經補救合成途徑合成，而且其前體并不是煙酸，而是煙酰胺(NAM)。NAM在體內煙酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT)的催化下生成煙酰胺單核苷酸(NMN)，后者經NMNAT催化并在ATP的參與下生成NAD，同時幫助其維持穩態。此反應為可逆反應且平衡常數接近于1，但現在認為在體內此反應趨向于向前發生。生理情況下此可逆反應會因缺乏焦磷酸(PPi)而受到抑制〔2〕。在催化過程中，三種不同的NMNAT亞型也具有不同的催化特性。在與NMN反應之前，ATP要先與細胞核中的NMNAT-1或高爾基體中的NMNAT-2相綁定，但線粒體中NMNAT-3所催化的反應順序卻正好相反，而且NMNAT-3利用ATP的效率更高。在反應速度方面，NMNAT-1和NMNAT-3的催化速率相似，NMNAT-2相對較慢。

2.2NMNAT：一種新的分子伴侶 分子伴侶是一類有助于多種蛋白復合裝配、蛋白折疊以及蛋白損傷后再折疊的蛋白質。NMNAT有獨立于其酶促反應之外的分子伴侶功能。它可以在蛋白折疊過程中與APT相耦聯。如果去掉其羧基端，包括與ATP的綁定位置，則分子伴侶功能失效而NAD合成活性不變。通過對果蠅NMNAT(dNMNAT)的研究，科學家發現它可以使非本體的蛋白質構造更加穩固，還可以促使錯誤折疊的蛋白質降級或正確折疊。無論是野生型還是無活性的dNMNAT都可以在熱休克導致的蛋白質變性中保護熒光素酶，從而在蛋白質結構恢復過程中使熱變性的熒光素酶適當的再折疊，發揮與熱休克蛋白70(HSP70)，HSP40以及HSP16.2相類似的作用。另外，重組dNMNAT可以在熱變性中保護檸檬酸合酶。NMNATs還可以減少蛋白聚合。在酵母菌蛋白研究模型中，NMNAT-1和NMNAT-2通過清理毒性蛋白減少了α突觸核蛋白—多聚谷氨酰胺介導的蛋白水解應激〔7〕。NMNAT還是一種新型應激反應蛋白。dNMNAT的過表達能夠增加氧化應激時果蠅的耐熱性，從而延長果蠅壽命。在活體試驗中，熱休克因子(HSF)與編碼NMNAT基因的啟動子相綁定，誘導熱休克條件下NMNAT的表達。相反，在缺氧條件下，缺氧誘導因子1α(HIF1α)在HSF的介導下可直接上調NMNAT〔8〕。

2.3NMNATs的基因調控功能 近年來，NMNATs的基因調控功能也愈加被人們所重視。科學家Zhang等發現哺乳動物細胞核內NMNAT-1作為基因調節因子在PARP-1和SIRT1的介導下可以調節目的基因的表達，例如ATXN10和NAT1，這些基因調控作用大多依賴NMNAT所催化的NAD合成；而也有一些基因的調控依賴于SIRT1的募集作用，SIRT1將NMNAT-1募集到目的基因的啟動子，調控其轉錄過程〔7〕。

2.4年齡相關的滔蛋白病變與NMNAT 滔蛋白病變是一種與年齡密切相關的中樞神經系統疾病，以滔蛋白的異常磷酸化和過度聚合為特點。隨著年齡的增長，滔蛋白在中樞神經系統的過度表達會引發大腦皮質神經細胞內空泡的形成和神經纖維變性，導致年齡相關的自發性活動的減少以及嚴重的學習和記憶功能障礙，甚至引發癡呆(阿爾茨海默病)。Yousuf等科學家曾以果蠅為實驗模型，發現中樞神經系統NMNAT水平是學習和記憶功能障礙發生年齡的重要決定因素，中樞神經系統NMNAT水平的降低會導致學習和記憶功能障礙發病年齡的提前。在滔蛋白病變模型中，中樞神經系統中NMNAT的過表達可以明顯改善年齡相關的學習和記憶功能缺陷。

3 NMNAT與糖代謝

3.1胰腺內NMNAT的表達 2004年美國科學家Yalowitz等成功克隆出人NMNAT的cDNA，并利用其指導合成了人NMNAT-2，確認人NMNAT的cDNA含有92個堿基對并指導合成了這個擁有307個氨基酸的多肽鏈，也提出盡管人NMNAT-2與人NMNAT-1僅有34%～35%的氨基酸序列同一性，但其酶活性卻與NMNAT-1相似。由于NAD的消耗會引起ATP池和GTP池當中ATP和GTP含量下降，并由此導致胰島β細胞損害引發胰島素依賴型糖尿病(IDDM)〔9〕，于是人工合成了人NMNAT-2唯一的表面抗原決定簇抗體，并在對正常成人胰腺取材進行免疫組化分析后驚異的發現，胰腺外分泌細胞當中NMNAT-2蛋白表達很少，而人胰島細胞上卻有明顯的NMNAT-2蛋白表達。雖然他們認為NMNAT-2在胰島β細胞內的表達應與其相似，但還不能將此表達直接定位于胰島β細胞，此后從胰島素瘤病人的胰腺組織中提取出可以分泌胰島素的腫瘤細胞，并確認了其中NMNAT-2的高表達；而且因為胰島β細胞對于NAD的消耗非常敏感，NMNAT-2的高表達會增加胰島β細胞的生存概率。這些都佐證了NMNAT-2在人胰島β細胞中的表達應與胰島其他細胞相一致〔10〕。

NAMPT為人們所熟知是以其另外一個身份：內脂素(visfatin)，它是內臟脂肪組織分泌的脂肪因子，是連接脂肪組織、炎癥和免疫的紐帶。其后人們又發現其蛋白結構與前B細胞克隆因子蛋白結構一致，而現在又已證實visfatin和NAMPT確為同一物質。因此，NAMPT現也被稱為visfatin/PBEF/NAMPT〔11〕。NAMPT位于NAD生物合成途徑的上游，其作用是催化NAM生成NMN。Karen等用qRT-PCR方法評估了人胰島組織當中NAMPT的基因水平，并用免疫熒光/共焦成像法測定了其在胰島組織中的表達，同時也闡述了葡萄糖對于人胰島β細胞當中NAMPT的表達、分泌和調節的影響。這也從某種程度上與NMNAT在胰島β細胞當中的表達相契合〔12〕。

3.2NMNAT與SIRT1 SIRT1是去乙酰化酶(Sirtuins)家族當中七個成員(SIRT1-7)之一，是NAD依賴的脫乙酰酶類，其對于糖脂代謝的重要作用廣為人知〔13～15〕：它不僅能夠促進哺乳動物的脂肪代謝和脂肪酸氧化，而且其活性的改變還參與了衰老和肝臟脂肪變性等病理生理過程。最近有研究表明，SIRT1不僅可以抵抗氧化應激和炎癥給胰島β細胞帶來的損害，其對于代謝紊亂和衰老情況下胰島β細胞功能紊亂的調節也至關重要。為了證明定位于細胞核內的人NMNAT-1是NMNAT家族中負責調解SIRT1的關鍵酶，科學家Zhang等以 WldS 小鼠為模型研究發現細胞核內部NAD對SIRT1有調節作用。細胞Sir2和SIRT1的功能依賴于其脫乙酰酶活性，而這一活性需要NMNAT所催化的NAD輔助。NAM既是NAD補救合成途徑中NAD的前體，也是利用Sirtuins 和PARP-1且依賴NAD的蛋白修飾作用的副產物，它可以抑制Sir2和SIRT1 的活性。與此同時，在研究哺乳動物細胞核內SIRT1的控制作用時，人們已著眼于NAMPT和NMNAT-1這兩種NAD補救合成途徑當中的重要合成酶，他們利用NAM的消除和NAD的生成調節SIRT1活性〔16〕。一項在乳腺癌細胞上分別進行的NAMPT和NMNAT-1基因敲除實驗顯示，敲除后細胞內下降的NAD水平改變了基因表達的總體模式，而且SIRT1會與那些通常受NAMPT和NMNAT-1調節的基因啟動子相綁定，SIRT1和SIRT1組蛋白脫乙酰酶的活性也在這些啟動子上受到NAMPT和NMNAT-1調節〔17,18〕。

3.3SIRT1對胰島素分泌的影響 一項基于胰島β細胞特異性SIRT1過表達轉基因小鼠(BESTO小鼠)的研究顯示：SIRT1對于胰島β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)有陽性調節作用，增加胰島β細胞中SIRT1的含量可以明顯增強GSIS，并可改善BESTO轉基因小鼠的糖耐量。甚至在長達30 w的高脂飲食誘發的糖尿病條件下，仍可以增強GSIS。相反，SIRT1缺乏的小鼠模型則表現出GSIS功能下降，這進一步說明了SIRT1對于胰島β細胞GSIS功能調節的重要性〔19〕。Kathryn Moynihan Ramsey等在衰老的雄性BESTO小鼠模型上發現，西式的高脂飲食導致的體重增加和單一血脂增高都不足以消除SIRT1給胰島β細胞帶來的益處〔20〕。針對SIRT1調節胰島素分泌的機制，Bordone等科學家進行了深入的研究，他們發現UCP2可以引發葡萄糖刺激的胰島素分泌缺陷。UCP2的上調與細胞在受到葡萄糖刺激后無法增加ATP水平有關。而UCP2基因的敲除則可以使SIRT1水平較低的胰島β細胞恢復分泌胰島素的能力。最后經實驗證實：SIRT1正是通過與UCP2啟動子直接綁定來抑制UCP2，增加胰島素分泌，這一過程調節了葡萄糖生成ATP的解耦聯，而增高的ATP水平觸發了胰島β細胞膜去極化及鈣離子依賴的泡吐作用〔21,22〕。另有研究顯示：SIRT1可以分別通過FOXO1和核轉錄因子(NF-Κb)的p65亞單元的去乙?；瘜Υx應激和細胞因子介導的胰島β細胞死亡起保護作用〔19〕。最近也有學者認為，受NMNAT調節的NAD合成以及其依賴于SIRT1的促胰島素分泌機制有可能也參與了胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的促胰島素分泌過程。

3.4SIRT1對胰島素敏感性的影響 已有確鑿的證據證明在限制能量攝入(CR)的條件下，SIRT1介導的STAT3的去乙?；饔貌粌H可以增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，還能增強胰島素刺激的PI3-K信號。肝臟SIRT1的缺乏會損傷PPARα的功能，降低脂肪酸的β氧化，在高脂飲食條件下引發肝臟脂肪變性、炎癥反應和內質網應激〔23〕。在正常膳食情況下，肝臟SIRT1的缺乏會損傷哺乳動物mTORC2/AKT信號通路的作用靶點，引發慢性高血糖癥、氧化應激以及全身性胰島素抵抗〔24〕。在脂肪組織中，脂肪組織特異的SIRT1缺如會導致肥胖加重，使衰老和高脂飲食引發的糖尿病模型加重胰島素抵抗〔25〕。最近有研究發現，SIRT1可以促進PPARγ對Prdm16的募集作用和PPARγ去乙?；餐閷У陌咨窘M織的“棕色脂肪化”，進而改善胰島素敏感性〔26〕。

NMN是NMNAT介導的NAD生物合成途徑的中間產物，也是NAD的前體。Yoshino等科學家通過以糖尿病小鼠肝臟組織為模型的實驗，證實了NMN可以增加胰島素信號通路中AKT的磷酸化水平，進而改善胰島素敏感性〔27〕，還可以通過下調諸多胰島素抵抗相關基因的表達，如NF-ΚB、Lipin1、Pbk4等，從而改善胰島素抵抗。在這一調節過程中，SIRT1正是重要的中間環節之一〔28,29〕。

綜上所述，NMNATs作為生物體內重要的管家酶，其在氧化還原反應當中的重要地位毋庸置疑。依賴于NMNAT所維持的生物體內NAD水平，SIRT1的活性對胰島素分泌，胰島素抵抗等諸多方面發揮著重要作用。近年來，更有學者提出了“NAD WORLD”的概念〔30〕，其中包含了NAD依賴的SIRT1活性的改變、NAMPT-NMNAT所調節的NAD及其中間產物(NMN)的生物合成，它們共同組成了一個復雜的調節網絡，涵蓋了代謝與衰老的生理病理過程，調節方式，影響因素，治療靶點等多個領域。相信其無論在基礎研究還是在臨床預防治療方面都有無限的發展前景。

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