甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA和蛋白表達的生物學意義

（中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科，沈陽110004）

甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA和蛋白表達的生物學意義

劉臻，滕緒永，張恒瑋，張雷

（中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科，沈陽110004）

目的研究甲狀腺乳頭狀癌組織中趨化因子受體CXCR7mRNA和蛋白的表達，探討其表達在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展中作用。方法采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測79例甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織標本中CXCR7mRNA和蛋白的表達，分析CXCR7表達與臨床病理特征之間的相關性。結果甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達水平分別為1.61±0.80和1.101 4±0.693 8，明顯高于癌旁組織的0.74±0.45和0.092 7±0.096 1（均P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移相關，淋巴結轉移組中CXCR7mRNA和蛋白表達水平分別為1.87±0.72和1.444 3±0.671 0，明顯高于非淋巴結轉移組的1.30±0.79和0.691 7±0.463 9（均P＜0.05）；CXCR7蛋白表達與TNM分期相關，Ⅲ～Ⅳ期中CXCR7蛋白表達為1.534 1±0.673 2，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的0.954 6±0.642 1（P＜0.05）。結論CXCR7高表達與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移、分期相關，參與了甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展。

甲狀腺腫瘤；趨化因子受體；CXCR7；轉移

甲狀腺癌是常見的內分泌惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%。甲狀腺乳頭狀癌易發生頸部淋巴結轉移。越來越多的研究顯示趨化因子及其受體網絡參與了腫瘤發生、侵襲及轉移的多個環節。CXCR7是近年來發現的趨化因子受體，與其配體CXCL12結合后能調節細胞的增殖、生存、黏附等功能，并參與腫瘤的侵襲和轉移［1～5］。本研究應用實時定量PCR和Western blot檢測甲狀腺乳頭狀癌及相應癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達，探討CXCR7在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2010年6月5日至2011年11月18日在中國醫科大學附屬盛京醫院普外科行手術治療患者的甲狀腺乳頭狀癌標本79例，留取癌組織及癌旁2 cm組織，置液氮后轉入-80℃冰箱保存。癌旁2 cm組織經病理證實未發現癌細胞。所有留取的標本

均獲患者知情同意，并且有完整的臨床資料。

1.2 主要儀器與試劑

PCR引物、Trizol試劑、反轉錄試劑盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR染料法實時PCR試劑盒，購自日本TaKaRa公司。兔抗人CXCR7抗體，購自美國Proteintech公司。小鼠抗人GAPDH抗體，購自上海康成生物公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG和辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋技術公司。超敏ECL化學發光試劑盒，購自碧云天生物技術公司。

1.3 實時熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成：取60 mg組織標本，于液氮研磨成粉末，加入1 mL Trizol，勻漿處理。按照Trizol試劑說明書，一步法提取組織總RNA。提取的總RNA經紫外分光光度計檢測，各樣本的A260/A280比值在1.8～2.0，總RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。提取的總RNA保存于-80℃，用于逆轉錄。逆轉錄反應體系和條件均參照反轉錄試劑盒中的說明進行，逆轉錄反應體系20 μL，反應條件為37℃15 min，85℃5 s。合成的cDNA于-20℃下保存，待擴增。

1.3.2 實時PCR反應：實時PCR在ABI7500 Realtime PCR儀中進行，反應體系20 μL：SYBR預混液10 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1 μL，校正液ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2 μL，雙蒸水5.6 μL。擴增條件：95℃30 s，1個循環；95℃5 s，60℃34 s，40個循環。目的基因CXCR7引物：上游為5′-AGCATCAAGGAGTGGCTGAT-3′，下游為5′-TGTGCTTCTCCTGGTCACTG-3′，產物136 bp；內參照基因GAPDH引物：上游為5′-ACAGTCAGCCG CTTCTT-3′，下游為5′-GCCCAATACGACC AAATCC-3′，產物101 bp。根據熒光信號，檢測出每個反應體系中待測基因的Ct值。每個樣本均做3個復孔，取Ct值的平均值進行分析。CXCR7的基因相對表達量用2-△△Ct方法來分析。具體公式：△△Ct=［CtCXCR7（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）］-［CtCXCR7（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）］，以癌旁組織的平均Ct值作為校正，陰性對照用雙蒸水代替cDNA模板。

1.4 Western blot檢測

取80 mg組織標本，加入蛋白裂解液1 mL，勻漿裂解，12 000 g、4℃、10 min離心后，取上清液測定蛋白濃度。取20 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸變性5 min，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，蛋白通過濕轉轉移到PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉60 min，用1∶400的兔抗人CXCR7單克隆抗體于4℃孵育過夜，另用1∶15 000的鼠抗人GAPDH單克隆抗體作為內參。加入相應的二抗（1∶2 000），室溫下孵育90 min。底物化學發光ECL呈色。采用IPP圖像分析系統分析目的蛋白及內參蛋白的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以IOD的比值（CXCR7的IOD值/GAPDH的IOD值）作為CXCR7蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白的表達

2.1.1 甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中CXCR7 mRNA表達：甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中，CXCR7mRNA的陽性標本熒光定量擴增曲線呈典型的S型曲線（圖1），溶解曲線為單峰（圖2），排除非特異性擴增及引物二聚體的出現。甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織中CXCR7mRNA相對表達量分別為1.61±0.80和0.74±0.45，甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCR7mRNA表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（t=9.736，P＜0.05）。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7mRNA熒光定量擴增曲線Fig.1 The amplification curves of CXCR7 mRNA acquired from real?time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

圖2 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7 mRNA熒光定量融解曲線Fig.2 The melt curves of CXCR7 mRNA acquired from real?time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

2.1.2 甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中CXCR7蛋白的表達：與相應的癌旁組織相比，CXCR7蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的表達明顯升高，CXCR7蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的相對表達量為1.101 4±0.693 8，在癌旁組織中為0.092 7±0.096 1，二者差異有統計學意義（t=13.583，P＜0.05）（圖3）。

2.2 CXCR7mRNA和蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系

圖3 Western blot檢測甲狀腺乳頭狀癌與癌旁組織CXCR7蛋白Fig.3 Detection of CXCR7 protein in PTC and paracancerous tissue by Western blot

CXCR7mRNA表達與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移有關，淋巴結轉移組和非轉移組中CXCR7 mRNA相對表達量分別為1.87±0.72和1.30±0.79，2組之間差異有統計學意義（t=3.356，P＜0.05）。CXCR7蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移、TNM分期有關，淋巴結轉移組和非淋巴結轉移組中CXCR7蛋白相對表達量分別為1.444 3±0.671 0和0.691 7±0.463 9（t=5.868，P＜0.05），TNMⅢ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期組CXCR7蛋白表達量分別為1.534 1± 0.673 2和0.954 6±0.642 1（t=3.446，P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白表達與性別、年齡、腫瘤大小、病灶數目、被膜外侵犯無關（P＞0.05）。見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌CXCR7mRNA和蛋白表達與臨床病理特征的關系Tab.1 Correlation between expressions of CXCR7 mRNA and protein and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

3 討論

趨化因子及其受體是一類重要的細胞因子，不僅參與胚胎發育、炎癥、造血，而且參與腫瘤發生、發展、侵襲及轉移［6］。CXCR7是近年新發現的趨化因子受體，與其配體CXCL12結合后在腫瘤發生、發展和轉移過程中發揮重要作用［7，8］。研究報道，CXCR7高表達于多種腫瘤細胞系及多種惡性腫瘤，但正常細胞和相應的非惡性轉化的組織幾乎不表達CXCR7蛋白，只能通過Northern blot檢測到CXCR7mRNA的表達，并推測CXCR7蛋白是通過翻譯后方式進行調節［7～10］。我們之前采用免疫組化方法檢測了甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中CXCR7和CXCL12蛋白表達，發現癌組織中CXCR7和CXCL12蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，CXCR7和CXCL12蛋白陽性表達與淋巴結轉移相關；且CXCR7和CXCL12蛋白表達呈正相關趨勢，提示CXCR7和CXCL12參與了甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展［11］。本研究采用實時熒光定量PCR、Western blot進一步檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中CXCR7mRNA和蛋白水平的表達，無論在mRNA水平還是蛋白水平上，CXCR7在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯高于癌旁組織，表明在甲狀腺乳頭狀癌中CXCR7在轉錄水平即開始調節，這與Burns等［7］和邱明遠等［12］提出的CXCR7的表達是通過翻譯后修飾或轉錄后調控進行調節的觀點不同，提示在不同組織中CXCR7表達的調控方式可能不同。

研究報道CXCR7能促進腫瘤細胞的生長增殖、血管生成及細胞間黏附，參與了腫瘤的發生、侵襲與轉移［7，9，13］。邱明遠等［12］報道，結直腸癌組織中CXCR7蛋白的表達與淋巴結轉移、腫瘤分期相關。Iwakiri等［2］報道在Ⅰ期非小細胞肺癌中，CXCR7高表達與術后遠處轉移和低生存率相關。本研究分析了CXCR7mRNA和蛋白表達水平與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系，發現淋巴結轉移組的CXCR7mRNA和蛋白表達水平明顯高于非轉移組，而且CXCR7蛋白表達和臨床分期有關，TNMⅢ～Ⅳ期中CXCR7的蛋白表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，提示CXCR7高表達可能對甲狀腺乳頭狀癌淋巴結侵襲、轉移起到一定的促進作用。本研究中CXCR7 mRNA和蛋白表達水平與臨床分期的關系不一致，可能與本組病例數少有關，也提示在甲狀腺乳頭狀癌中CXCR7蛋白表達除了轉錄水平的調節，在轉錄后也可能存在調控，需要進一步研究。目前CXCR7在腫瘤中的作用機制還不是很清楚，Wang等［14］在前列腺癌的研究中發現，CXCR7可能通過激活AKT信號通路和上調白細胞介素8或血管內皮生長因子的表達來調控腫瘤的血管生成及發展；并可調節鈣黏連蛋白11、纖維連接蛋白1及基質金屬蛋白酶3、10、11等的水平，增強前列腺癌細胞的侵襲與轉移能力。Grymula等［15］報道CXCR7能通過誘導MAPK p42/44DE磷酸化來促進橫紋肌肉瘤細胞的增殖、侵襲。Barbero等［16］發現CXCR7還能通過活化ERK1/2信號通路誘導膠質瘤細胞的增殖。這些研究均表明CXCR7能通過多種途徑增強腫瘤細胞的侵襲性及轉移性。

綜上所述，CXCR7高表達與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移、分期相關，參與了甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展，但具體機制仍需要進一步研究。選擇性阻斷CXCR7，可能是控制甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移的一個有效途徑。

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（編輯 陳姜）

Expression of Chemokine Receptor CXCR7in Papillary Thyroid Carcinoma and Its BiologicalSignificance

LIU Zhen，TENGXu-yong，ZHANGHeng-wei，ZHANGLei
（DepartmentofGeneralSurgery，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the mRNA and protein expression of chemokine receptor CXCR7in papillary thyroid carcinoma and explore its biologicalfunction.MethodsThe expression of CXCR7mRNAand protein in 79 cases ofpapillary thyroid carcinoma and paracancerous tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot.The association between CXCR7expression and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma was analyzed.ResultsThe expression of CXCR7 mRNA and protein（1.61±0.80，1.101 4±0.693 8）was significantly higher in papillary thyroid carcinoma than in paracancerous tissues（0.74±0.45，0.092 7±0.096 1）（P＜0.05）.The expression of CXCR7mRNA and protein was correlated with lymph node metastasis.The expression level of CXCR7 mRNA and protein in the group with lymph node metastasis（1.87±0.72，1.444 3±0.671 0）was higherthan in the group withoutlymph node metastasis（1.30±0.79，0.691 7±0.463 9）（P＜0.05）.The levelof CXCR7 protein was relevant to TNM stages.The level of CXCR7 protein in stageⅢ-Ⅳ（1.534 1±0.673 2）was higher than in stageⅠ-Ⅱ（0.954 6± 0.642 1）（P＜0.05）.ConclusionThe high expression of CXCR7was related with lymph node metastasis and TNM stages.CXCR7may be involved in the tumorigenesis and progression ofpapillary thyroid carcinoma.

thyroid neoplasm；chemokine receptor；CXCR7；metastasis

R736.1

A

0258-4646（2014）02-0114-05

國家自然科學基金（81072182）；遼寧省自然科學基金（2013021100）

劉臻（1973-），男，副教授，博士.

E-mail：liuzhen1973@aliyun.com

2013-12-19

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