培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型水通道蛋白5表達的影響

（遼寧中醫藥大學生物化學與分子生物學教研室，沈陽110032）

培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型水通道蛋白5表達的影響

苗蘭英，王艷杰，郭雋馥，曹陽，趙丹玉，柳春

（遼寧中醫藥大學生物化學與分子生物學教研室，沈陽110032）

目的觀察培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型肺組織水通道蛋白5（AQP5）表達的影響，探討脾虛對哮喘氣道黏液高分泌形成的影響及培土生金法對其的調控作用。方法50只健康雄性Wistar大鼠，隨機分為5組：對照組、脾虛哮喘組、哮喘組、脾虛哮喘治療組、哮喘治療組，每組10只。采用RT-PCR測定大鼠肺組織AQP5mRNA表達水平，采用免疫組化測定肺組織AQP5蛋白表達水平。結果脾虛哮喘組、哮喘組與對照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織AQP5mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結論培土生金法能夠升高脾虛哮喘和哮喘時肺組織AQP5mRNA和蛋白表達水平。

培土生金；脾虛；哮喘；水通道蛋白；氣道黏液高分泌

哮喘是呼吸系統中常見的慢性疾病，氣道黏液高分泌是其主要的病理生理特征之一。氣道黏液的黏彈性主要取決于黏蛋白，但是黏蛋白的分泌與水和電解質的分泌是相互調節的，黏蛋白的絕對量增多與黏蛋白和水鹽的比例失衡有關［1，2］。水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）可能參與了黏蛋白表達和分泌，從而參與了氣道黏液高分泌的形成。AQP5可能成為治療哮喘、肺囊性纖維化等氣道黏液高分泌疾病的新靶點。本課題組前期研究表明，培土生金中藥可以顯著降低脾虛哮喘大鼠和哮喘大鼠BALF和肺組織中黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）的含量和表達，抑制哮喘大鼠肺組織核因子κB p65的活性，從而減少氣道黏液的黏蛋白含量，減輕氣道炎癥，改善氣道黏液高分泌［3，4］。因此，本實驗通過觀察培土生金中藥對脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5表達的影響，探討脾虛對哮喘氣道黏液高分泌形成的影響機制及培土生金中藥對AQP5的調控作用，為研究培土生金中藥治療脾虛哮喘的機制開辟新領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組：SPF級雄性Wistar大鼠50只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，體質量（200±20）g，周齡6～8周。許可證編號：SCXK（京）2007-0001。按隨機數字法分成5組：對照組、脾虛哮喘組、哮喘組、脾虛哮喘治療組和哮喘治療組，每組10只。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵蛋白（貨號GradeⅡ，A5253，美國Sigma公司），兔抗大鼠AQP5一抗（武漢博士德生物工程有限公司），Trizol Reagent、TaKaRa RNA PCR試劑盒（TaKaRa大連寶生物公司），WD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一儀器廠），電泳儀（EPS300型，上海天能科技有限公司），KCW-6T超聲霧化器（南京杰西電器有限公司），低溫高速冷凍離心機（TGL-20M型，長沙湘儀離心機儀器有限公司），手動石蠟切片機、包埋機（EG1150C型，德國LEICA公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立和評價：脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組參考文獻［5］的方法并改進，連續10 d采用飲食不節、過度疲勞和苦寒泄下等方法共同作用，建立脾虛大鼠模型。當動物出現體質量下降、進水量增多、進食量減少、肛溫升高、排便次數增多、便溏、倦怠少動、游泳耐力下降、皮毛光澤度下降等變化，提示脾虛模型造模成功。脾虛造模成功后，脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組再與哮喘組、哮喘治療組一起采用致敏和激發的方法建立哮喘模型。在實驗的第11、13和15天，腹腔注射抗原液1 mL致敏（由卵蛋白100 mg、滅活百日咳桿菌疫苗5×109個、氫氧化鋁凝膠100 mg的生理鹽水溶液配制而成）。致敏后第15天開始將大鼠放入霧化箱內，每日將1%卵蛋白溶液用超聲霧化器噴霧激發，每次30 min，共7 d。當激發時大鼠出現呼吸喘促、點頭、腹肌抽動等呼吸困難癥狀，提示哮喘模型造模成功。

1.2.2 處理因素：造模成功后用培土生金中藥，由黃芪、人參、防風、白術等9味中藥按比例組成，常規煎煮2次，去渣留液，濃縮為1 g/mL生藥。按照人鼠劑量換算，折合成人的等效劑量的10倍。從實驗的第11天開始對脾虛哮喘治療組和哮喘治療組進行灌胃，2次/d，每次1 mL/100 g體質量，連續21 d。

1.3 標本檢測

1.3.1 大鼠肺組織濕/干質量比值的測定：右肺下葉稱量濕質量后，放入56℃恒溫箱烤干，72 h后（至衡質量后）稱干質量，計算濕/干質量比值。

1.3.2 大鼠肺組織AQP5mRNA表達：采用Trizol進行肺組織總RNA提取，采用RT-PCR試劑盒分兩步進行RT-PCR反應。內參照β-actin和AQP5［6］的引物序列：上游5′-CAGCACTCAAGTGGCCCTCGGCTC -3′，下游5′-AAAGATCGGGCTGGGTTCATGGAA-3′，擴增片段長度500 bp。β-actin引物序列：上游5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′，擴增片段長度592 bp。PCR反應條件：94℃預變性，2 min；94℃變性，30 s；65℃退火，30 s；72℃延伸，1 min；72℃延伸，5 min；瓊脂糖凝膠電泳；利用WD-9413B凝膠成像分析儀進行圖像分析，用Gelpro32軟件測量目的基因和內參的平均光密度值，并計算兩者的比值，以該比值反映目的基因的mRNA表達水平。

1.3.3 大鼠肺組織AQP5的表達：采用免疫組化SABC法測定肺組織AQP5表達，采用BI2000醫學圖像分析系統進行圖像分析，選取200倍圖像，細胞質或胞膜著棕黃色為AQP5陽性表達細胞，隨機選取5個視野進行平均光密度測定，取其平均值作為該切片的代表值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型肺組織濕/干質量比值的影響

肺組織濕/干質量比值是用來評估肺水腫或肺水失衡的指標。脾虛哮喘組、哮喘組與對照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，肺組織濕/干質量比值均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織濕/干質量比值均顯著降低（P＜0.01）。見表1。

2.2 培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5mRNA表達的影響

脾虛哮喘組、哮喘組與對照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）。脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織

AQP5mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）。見表1。

2.3 培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型肺組織AQP5蛋白表達的影響

AQP5主要表達在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細胞及黏膜下腺。脾虛哮喘組、哮喘組與對照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組比較，大鼠肺組織AQP5蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；脾虛哮喘治療組與脾虛哮喘組比較，哮喘治療組與哮喘組比較，肺組織AQP5蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。見表1。

表1 培土生金法對脾虛哮喘大鼠模型肺組織濕/干質量比值及AQP5mRNA和蛋白表達的影響Tab.1 The effect of“reinforcing earth to strengthen metal”on lung wet/dry weight ratio，AQP5 mRNA and protein in rats′lung in spleen?deficiency bronchial asthma

3 討論

哮喘是以氣道炎癥、氣道高反應、黏液高分泌及氣道重塑為主要病理特征的慢性呼吸道疾病。氣道黏液高分泌的形成與黏蛋白和水鹽比例失調導致黏液變得稠厚有關。AQPs、氯通道和鈉通道等上皮通道蛋白都參與了呼吸道的水鹽離子轉運，對于調節氣道表面液體的成分和厚度等都有重要作用。目前的研究表明，AQP5主要表達在肺泡Ⅰ型上皮細胞和黏膜下腺細胞［7，8］。AQP5是黏膜下腺體液體分泌的主要參與者，黏膜下腺AQP5的減少能導致氣道液體分泌減少及黏蛋白濃度增加［9］，AQP5的表達在哮喘發病過程中對改變氣道炎性反應及黏液高分泌起著關鍵作用［10，11］。陳智鴻等［12］研究表明，AQP5的基因缺失可使小鼠氣道對過敏原的應激性增加。另有研究報道，AQP5與氣道高反應性、氣流受限、調節氣道水穩態有關［13］。以上研究結果表明AQP5參與了氣道黏液分泌，與氣道黏液高分泌的形成密切相關，并且與氣道高分壓有關。因此深入研究AQP5與氣道黏液高分泌形成及其與氣道黏蛋白表達和分泌調控的相關性，必將為氣道黏液高分泌疾病的研究提供靶點。

祖國傳統醫學很早就對體內水的轉運和代謝進行了描述，把體內一切正常水液稱為津液，包括各臟腑組織的內在體液和其正常分泌物。津液的生成、輸布和排泄與各臟腑功能密切相關，特別是肺脾腎三臟。脾為后天之本，主運化水液，為津液代謝之樞紐。脾能將津液上輸于肺或直接布散全身，以灌四旁。脾失健運，則水濕內停，而至水飲，痰飲，水瀉。脾虛時津液代謝紊亂，影響肺的呼吸功能。氣道黏液是氣道內正常的分泌物，應屬于中醫學中的“津液”，氣道黏液高分泌是津液代謝紊亂的結果。王艷杰等［3，14］前期實驗研究表明，脾虛能夠使肺組織MUC5AC表達水平進一步升高及AQP5表達進一步降低，說明脾虛能影響肺組織的津液代謝，引起氣道黏液高分泌。本實驗通過觀察脾虛哮喘大鼠模型肺AQP5表達變化，進一步揭示哮喘氣道黏液高分泌形成機制和培土生金法治療哮喘的機制，為揭示脾與肺在水液代謝中的相關性提供實驗依據，為“脾主運化水液”提供分子基礎。

本實驗結果顯示：脾虛能夠使哮喘大鼠肺組織濕/干質量比值進一步升高，并且還能夠使肺組織AQP5mRNA和蛋白表達水平進一步降低。脾虛哮喘和哮喘時肺組織AQP5的表達水平和支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC含量及肺組織MUC5AC的表達呈負相關，加重哮喘時的肺水失衡，說明肺組織AQP5表達水平和氣道黏液中的MUC5AC含量及肺組織MUC5AC表達水平密切相關。由此推測哮喘時肺組織AQP5表達水平降低，可能是導致氣道黏蛋白表達增高和黏蛋白分泌過多的原因之一。脾虛能夠加重哮喘氣道黏蛋白的表達和分泌，可能是通過改變AQP5的表達實現的。培土生金中藥能夠使脾虛哮喘模型和哮喘模型組大鼠肺組織濕/干質量比值降低，肺組織AQP5mRNA和蛋白表達水平

升高，從而使支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC含量降低，肺組織MUC5AC表達降低。培土生金法是通過調控肺組織AQP5的表達，調節黏蛋白的分泌，改善氣道黏液高分泌。

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（編輯 陳姜）

The Effectof“Reinforcing Earth to Strengthen Metal”on Aquaporin 5 Expression in Ratswith Spleen-deficiency in BronchialAsthma

MIAOLan-ying，WANG Yan-jie，GUOJuan-fu，CAO Yang，ZHAO Dan-yu，LIUChun
（DepartmentofBiochemistry and MolecularBiology，Liaoning University ofTraditionalChinese Medicine，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo observe the effect of“reinforcing earth to strengthen metal”on aquaporin 5（AQP5）expression in rats with spleendeficiency in bronchialasthma，and analyze the relationship ofspleen-deficiency with airway mucus hypersecretion formation and the effective mechanism of the“reinforcing earth to strengthen metal”method.Methods50 healthy male Wistar rats were randomly divided into 5 groups：control group，spleen-deficiency asthma group，asthma group，spleen-deficiency asthma treatment group，and asthma treatment group（n=10）.Expression of AQP5mRNAin the lung was detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），and AQP5 protein expression was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of AQP5mRNA and protein in the lung tissue of rats was significantly decreased in spleen deficiency asthma group comparing with the asthma group（P＜0.01）.The expression level of AQP5mRNA and protein in lung tissue was significantly increased in spleen deficiency asthma treatment group and asthma treatment group comparing with spleen deficiency asthma group and asthma group，respectively（P＜0.01）.ConclusionThe expression level of AQP5mRNA and protein in spleen deficiency asthma or asthma lung tissue can be significantly increased by the treatmentof“reinforcing earth to strengthen metal”.

reinforcing earth to strengthen metal；spleen-deficiency；asthma；aquaporin；airway mucus hypersecretion

R285.5

A

0258-4646（2014）02-0118-04

國家自然科學基金（81202789）；遼寧省教育廳高校科研計劃（2009A500）；遼寧省博士啟動基金（20111134）

苗蘭英（1966-），女，高級實驗師，本科.

王艷杰，E-mail：wangyj76@yahoo.com.cn

2013-12-10

網絡出版時間：