OGR1籍ERK信號通路參與酸性微環境致氣道上皮細胞黏蛋白5AC表達

周萬，周向東，尤列·皮爾曼，維克多·科羅索夫

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶400010；2.俄羅斯醫學科學院遠東呼吸生理與病理中心，布拉戈維申斯克675000）

OGR1籍ERK信號通路參與酸性微環境致氣道上皮細胞黏蛋白5AC表達

周萬1，周向東1，尤列·皮爾曼2，維克多·科羅索夫2

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶400010；2.俄羅斯醫學科學院遠東呼吸生理與病理中心，布拉戈維申斯克675000）

目的探討氣道酸性微環境誘導氣道上皮細胞黏蛋白5AC表達的上游信號通路調節機制。方法體外培養人氣道上皮細胞（16HBE），以氯化氫創造細胞酸性環境（pH 6.4），以細胞外信號調節激酶（ERK）特異性抑制劑PD88059及卵巢癌G蛋白耦聯受體1（OGR1）siRNA進行干預，將細胞隨機分為8組：對照組、酸刺激組、酸刺激+轉染OGR1siRNA組、pH 7.4+OGR1 siRNA組、酸刺激+陰性siRNA組、pH 7.4+陰性siRNA組、酸刺激+PD98059組、pH 7.4+PD98059組。采用RT-PCR、ELISA法分別觀察細胞黏蛋白（MUC）5AC轉錄水平及培養上清液中MUC5AC蛋白水平的改變；Western blot法檢測OGR1蛋白及p-ERK蛋白的相對含量。結果酸刺激組內細胞MUC5AC轉錄及蛋白水平顯著高于對照組（P值均＜0.05），其OGR1及p-ERK蛋白含量較對照組亦明顯增加，酸刺激+轉染OGR1siRNA組MUC5AC mRNA轉錄及蛋白水平顯著低于酸刺激組（P值均＜0.05），其p-ERK含量亦明顯降低。而pH 7.4+OGR1siRNA組MUC5AC蛋白含量及mRNA水平較pH7.4對照組無明顯差別，其p-ERK含量也變化不大。酸刺激+PD98059組MUC5AC mRNA轉錄及蛋白水平顯著低于酸刺激組（P值均＜0.05），而pH 7.4+PD98059組較對照組MUC5AC mRNA轉錄及蛋白水平無明顯差異。結論OGR1可能通過激活ERK信號通路參與氣道酸性微環境所致的人氣道黏膜上皮細胞MUC5AC表達。

黏蛋白；酸性環境；卵巢癌G蛋白耦聯受體1；細胞外信號調節激酶

氣道黏液高分泌是諸如慢性阻塞性肺疾病、哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征［1］，大量研究結果顯示慢性氣道炎癥性疾病多導致氣道微環境酸化，而持久的氣道酸性微環境進一步加重氣道黏液高分泌，其最主要的病理性表達產物是氣道黏蛋白（mucin，MUC）5AC［2］，但酸暴露下參與這一過程的具體信號轉導途徑尚有待明確。國外研究報道，G蛋白耦聯受體家族中卵巢癌G蛋白耦聯受體1（ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1）作為一種質子敏感型受體，目前被眾多研究證實參與酸性環境刺激下細胞信號調節通路。而細胞外信號調節激酶（extra cellular signal-regulated kinase，ERK）［3］作為多條信號轉導路徑的匯總點，有報道顯示參與了其下游信號轉導途徑。鑒于ERK在氣道黏蛋白5AC高表達的信號轉導通路中居重要地位。故此，我們推測氣道在酸性環境下激活OGR1可引起ERK活化，從而誘導MUC5AC病理性高表達。本研究旨在進一步探討氣道酸性環境下黏蛋白5AC過度表達的上游關鍵信號調節途徑及其在氣道黏液高分泌中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管氣道上皮細胞（16HBE）購自ATCC（美國），DMEM培養液、HEPES、Trizol、胎牛血清、抗β-actin單克隆抗體、ERK特異性抑制劑PD98059（Sigma，美國），OGR1siRNA和對照siRNA（吉凱，中國），小鼠抗MUC5AC單克隆抗體（45MI）（NeoMarkers，美國），兔抗磷酸化ERK多克隆抗體、HRP-羊抗兔抗體、HRP-羊抗小鼠抗體（Santa Cruz，美國），人MUC5AC ELISA試劑盒（R&D system，美國），Fu-GENE6試劑（Roche，美國）。

1.2 細胞培養及分組

于6孔板中培養16HBE細胞，每孔（5～6）×105個細胞，加入2 mL DMEM培養液（含10%牛胎血清，鏈霉素（100 μg/mL），青霉素（100 μg/mL），HEPES（25 mmol/L），37℃，5%CO2培養箱孵育，常規換液培養，當細胞達70%～80%融合時傳代，將細胞分為8組，對照組：無胎牛血清無雙抗的DMEM培養基中繼續培養細胞，給予適宜濃度氯化氫使維持pH 7.4；pH 6.4組：細胞于無血清培養液、pH6.4培養；pH 6.4+OGR1siRNA組（轉染OGR1 siRNA后，于無血清培養液、pH6.4培養）；pH 6.4+siRNA陰性對照組（以陰性siRNA轉染后于無血清培養液；pH6.4培養）；pH 7.4+OGR1 siRNA組（以OGR1 siRNA轉染后于無血清培養液；pH7.4培養）；siRNA陰性對照組（以陰性siRNA轉染后，無血清培養液；pH7.4培養；pH 6.4+PD98059組（細胞給予ERK抑制劑PD98059 50 μmol/L后，無血清培養液；pH6.4培養）；pH 7.4+ PD98059組（細胞給予ERK抑制劑PD98059 50 μmol/L后，無血清培養液、pH7.4培養）。每組設5個復孔用于統計學分析（n=5），實驗重復4次。

1.3 MTT法檢測各組細胞活力

在96孔板里加入200 μL細胞懸液，每孔細胞密度約l×104/mL。每組8個復孔，分別在8、16、24及36 h時間點進行細胞活力測定。

1.4 細胞轉染

OGR1siRNA試劑由中國吉凱生物化學有限公司合成，OGR1 siRNA序列為5′-CAA UUC AGG UUC CUC GCC G（dTdT）-3′，陰性siRNA序列為5′-GCG CGC UUU GUA GGA UUC G（dTdT）-3′。將處于對數生長期的細胞調整濃度至（1～2）×109/L，孵育12 h，當細胞融合達30%～50%時進行轉染，操作步驟按FuGENE6說明書進行，以陰性siRNA為陰性對照，轉染后24～48 h后進行細胞處理并行相關檢測。

1.5 ELISA法測上清液MUC5AC蛋白含量吸取培養基上清液，40℃包被96孔酶標反應板，干燥，PBS清洗酶標板3次，2%小牛血清室溫封閉1 h，加入小鼠單克隆MUC5AC抗體（1∶100，用含0.05%Tween-20的PBST稀釋50 μL），孵育1 h；洗滌3次，加入辣根過氧化物酶-羊抗小鼠IgG（1∶10 000）孵育1 h；四甲基聯苯胺過氧化物酶溶液顯色，1 mol/L H2SO4終止反應后測各孔A值（λ=450 nm），與標準品比較而得到黏蛋白MUC5AC的相對值。

1.6 逆轉錄PCR檢測MUC5AC mRNA

采用Trizol法分別提取各組細胞內的總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測RNA在260 nm和280 nm的吸光度（A）值，樣品A260/A280比值均介于1.8～2.0，根據260 nm的A值對樣品的總RNA初步定量，保存于-20℃備用。隨后以兩步法行RTPCR。參照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。MUC5AC的PCR引物序列（由生工生物工程有限公司提供）上游5′GAGGGCCCAGTGA GCATCTCC 3′，下游5′TGGGA-

CAGCAGCAGTATTCAGT 3′。滅菌PCR管中依次加入MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL、10×PCR反應緩沖液5.0 μL、上下游引物各1.0 μL、dNTP 4.0 μL、cDNA 2.0 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，定容至50.0 μL，輕輕混勻離心后行PCR擴增。于94℃預變性10 min，后緊隨30個循環，循環參數：94℃30 s，57℃45 s，70℃45 s，后72℃延伸7 min補齊末端。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，約540 bp處為目的基因片段。電泳結果經光密度面積積分分析，以與βactin mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對含量。

1.7 Western印跡分析相關蛋白含量

細胞加入冰預冷的裂解液，冰浴20 min，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液經8%聚丙烯酰胺（SOS）凝膠電泳分離，印跡轉移至硝酸纖維素膜，于5%BSA中封閉1 h后，分別加入兔抗磷酸化ERK多克隆抗體（1∶1 000）和兔抗OGR1多克隆抗體（1∶500）4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的第二抗體（1∶10 000），37℃孵育1 h。徹底洗滌后經增敏化學發光法顯色，加入底物與反應液后，顯色5 min。結果經光密度面積積分分析，以與內參照βactin產物條帶的比值作為相對含量。

1.8 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件包分析，多組數據間差異分析采用多組間單因素方差分析，兩組間單因素分析采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測各組細胞活力

各組細胞在同一時間點吸光度無統計學差異（表1）。

表1 各組細胞在不同時間點增殖活力的比較Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

表1 各組細胞在不同時間點增殖活力的比較Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

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2.2 轉染16HBE細胞表達情況的鑒定

Western blot結果顯示OGR1siRNA轉染后其表達蛋白明顯減少，提示轉染成功（圖1）。

圖1 Western blot檢測OGR1沉默效率Fig.1 The expression of the OGR1 receptor in 16HBE cells measured by Western blot

2.3 各實驗組MUC5AC mRNA轉錄水平及細胞培養上清液中MUC5AC分泌水平

給予培養液細胞維持pH值為6.4的酸性微環境后，與對照組相比，其MUC5AC mRNA轉錄水平明顯上升（t=-33.67，P=0.000），而轉染OGR1siRNA后幾乎完全阻斷酸暴露下上調的MUC5AC轉錄水平（t=18.06，P=0.000），而轉染陰性siRNA組與對照組相比MUC5AC mRNA轉錄水平無統計學差異（t=-0.02，P=0.490）；未給予酸刺激的對照組分別與pH 7.4+陰性siRNA組、pH 7.4+OGR1siRNA組比較MUC5AC mRNA轉錄水平無統計學差異（t值分別為-0.46、0.38；P值分別為0.330、0.350）（表2）。細胞培養上清液中的MUC5AC蛋白分泌水平與MUC5AC mRNA轉錄水平變化一致（表2）。

2.4 酸性刺激及PD98059預處理對p-ERK及MUC5AC蛋白含量及mRNA轉錄水平的影響

pH 6.4+PD98059預處理后p-ERK含量（圖2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA轉錄水平較pH 6.4組顯著降低（t=16.75，P=0.000），而pH 7.4+PD98059組的p-ERK含量（圖2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA轉錄水平與pH 7.4對照組相比差異無統計學意義（t=0.75，P=0.238）（表2）。

表2 各組細胞MUC5AC轉錄水平及培養上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

表2 各組細胞MUC5AC轉錄水平及培養上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

Compared with pH 7.4 control group：1）P＜0.05；compared with pH 6.4 group：2）P＜0.05.

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圖2 酸刺激及PD98059預處理對ERK磷酸化水平的影響Fig.2 The effect of acidic stimulation and PD98059 on the phosphorylation level of ERK

2.5 酸刺激及轉染OGR1siRNA對p-ERK蛋白含量影響

pH 6.4+OGR1siRNA組與pH 6.4組相比ERK的磷酸化水平明顯下降，MUC5AC蛋白含量及水平也明顯降低（P＜0.05），而pH 7.4+OGR1siRNA組p-ERK含量、MUC5AC蛋白及mRNA水平較對照組無明顯影響，但均明顯低于酸預處理組（P＜0.05）（圖3，表2）。

圖3 酸刺激及轉染OGR1siRNA對ERK磷酸化水平的影響Fig.3 The effect of acidic stimulation and OGR1 siRNA on the phosphorylation level of ERK

3 討論

氣道酸性微環境是慢性氣道炎癥時小氣道的普遍表現，正常人氣道微環境pH在7.5～7.7，但慢性氣道炎性疾病諸如哮喘患者氣道微環境pH值多在5.2～7.1之間［4］，故本實驗選擇pH 6.4中間值作為對照研究，許多研究已經表明質子敏感型離子通道包括對酸刺激及辣椒素敏感的瞬時感受器陽離子通道［5］等在酸誘導的各種病理生理表現如氣道狹窄、氣道高反應性、高分泌中扮演了重要的角色，但是目前對于氣道酸環境所致的各種病理性改變信號通路機制仍不清楚。

質子敏感G蛋白耦聯受體家族，包括誘導細胞停滯于G2/M期的G蛋白耦聯受體G2A（G2 accumulation）、T細胞死亡耦聯基因8（T cell death associated gene 8，TDAG8）、G蛋白耦聯受體4（G protein coupled receptor 4 GPR4）及OGR1，在人體組織細胞中廣泛分布，但只有OGR1和GPR4高表達于肺組織中。該類受體能通過組氨酸殘基感知胞外質子或pH值的變化［6］，從而介導細胞內多種信號通路。有研究提示OGR1在pH7.4～7.6范圍內即可被激活，而進一步實驗發現在pH6.4～6.8范圍可被充分激活［7］。國外報道質子敏感型受體OGR1可介導氣道酸性微環境所致的氣道平滑肌收縮［8］、氣道重塑，還可刺激IL-6的產生，而IL-6作為前炎性因子，在哮喘氣道炎性反應中起重要作用［9］，研究表明OGR1還可通過OGR1/Gq/PLC信號通路介導［Ca2+］依賴的MUC5AC出胞［10］。故OGR1在氣道炎性疾病導致的各種病理生理改變有重要作用，可能是酸性環境下MUC5AC mRNA高表達的上游信號調節的重要靶點，并在氣道黏液高分泌的形成中發揮關鍵作用。

本研究顯示酸暴露下氣道MUC5AC mRNA及其蛋白表達明顯增強，而轉染OGR1siRNA后明顯

降低由酸性微環境所致的氣道MUC5AC mRNA及其蛋白含量，較未給予酸暴露的對照組相比差異明顯，此研究結果與國外在其他系統的研究結論相同，證實了OGR1可能是氣道上皮細胞接收酸刺激信號的重要膜靶點，其在接收酸刺激信號后進一步向胞內傳導，從而引發氣道酸性微環境下的黏液高分泌。

ERK是多條信號轉導通路的共同匯總點，已有報道低pH環境下可誘導人A431細胞ERK磷酸化增強［11］。在胃食管返流患者中，食管低pH環境可增強ERK的表達，促進食管細胞的增殖［12］。目前已公認ERK在各種因素誘導的氣道MUC5AC高表達信號轉導通路中居重要地位。

本研究結果發現，在酸性微環境中p-ERK表達明顯增強，給予其特異性抑制劑PD98059后ERK的活化減弱，且實驗中MUC5AC mRNA及其蛋白含量也明顯降低，進一步實驗發現，轉染OGR1siRNA的實驗組中p-ERK含量明顯降低，說明抑制OGR1的表達能降低p-ERK的水平，提示酸暴露下ERK的激活有賴于OGR1的作用。上述研究結果表明，OGR1能通過活化ERK誘導MUC5AC mRNA及其蛋白的高表達，從而參與酸暴露所致的黏液高分泌形成過程。

綜上所訴，本研究探討了酸暴露下氣道MUC5AC mRNA及其蛋白高表達的上游信號分子，提示OGR1/ERK途徑可能是其主導信號通路，研究結果進一步完善了對慢性氣道炎癥時黏液高分泌形成機制的認識，也提供了一個可能有現實意義的干預靶點。

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（編輯 裘孝琦）

Study of OGR1/ERKMediated Mechanism for the Acid-induced Mucin 5ACExpression and Secretion in Human Airway Epithelial Cells

ZHOUWan1，ZHOU Xiang-dong1，Juliy M.Perelman2，VictorP.Kolosov2
（1.Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Far Eastern Scientific Center ofPhysiology and Pathology ofRespiration，Siberian Branch，Russian Academy ofMedicalSciences，Blagoveshchensk 675000，Russia）

ObjectiveTo explore the related signal transduction mechanism in acid-induced expression of MUC5AC mRNA by airway epithelial cells.Methods16HBE cells were stimulated by hydrogen chloride，and treated with OGR1siRNA and an inhibitors to ERK（PD98059）.Cells were divided into 8 groups：the control group（pH 7.4），the acidic stimulation group（pH 6.4），the acidic stimulation+OGR1siRNA group，the pH 7.4+OGR1siRNA group，the acidic stimulation+control siRNA group，the pH 7.4+control siRNA group，the acidic stimulation+PD98059 group，and the pH 7.4+PD98059 group.The transcription level of mucin（MUC）5AC was evaluated with reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.The MUC5AC secreted in supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of OGR1 protein and the protein levels of phosphorylation extracellular signal-regulated kinase（p-ERK）were measured by Western blot.ResultsThe expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels were remarkably higher in the acidic stimulation group compared with those in the control group（P＜0.05）.The expression of OGR1and p-ERK protein also significantly increased.The expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels in the acidic stimulation+OGR1siRNA group were also significantly lower than those in the control group and its p-ERK decreased remarkably.There is no significant difference in expression of MUC5AC mRNA and mRNA level between the control group and p-ERK also showed no significant change after transfection of OGR1siRNA.The secretion level of MUC5AC and the expression of MUC5AC mRNA were much lower in the acidic stimulation+PD98059 group than in the acidic stimulation group（P＜0.05），while there were no significant difference between the control group and the pH 7.4+PD98059 group in the secretion levelofMUC5AC and expression of MUC5AC mRNA（P＞0.05）.ConclusionOGR1/ERK transduction cascade may be uppersignalregulatorsin acid-induced MUC5ACexpression in 16HBE cells.

MUC5AC；acidic stimulation；ovarian cancer G protein-coupled receptor 1；extra cellular signal-regulated kinase

R310.17

A

0258-4646（2014）02-0122-05

國家自然科學基金（81370111）；國家自然科學基金中俄國際合作項目（31211120168）

周萬（1988-），男，碩士，研究生.

周向東，E-mail：zxd999@263.net

2013-11-12

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