骨髓間充質干細胞延緩大鼠殘腎模型腎纖維化的研究

邊曉慧，趙桂鋒，孫立，劉娜，李德天，馮江敏

（1.中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，沈陽110001；2.中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽110004；3.中國醫科大學附屬盛京醫院先天畸形研究中心實驗室，沈陽110004；4.內蒙古鄂爾多斯市中心醫院腎內科，內蒙古鄂爾多斯017000）

骨髓間充質干細胞延緩大鼠殘腎模型腎纖維化的研究

邊曉慧1，2，趙桂鋒3，孫立1，劉娜4，李德天2，馮江敏1

（1.中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，沈陽110001；2.中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽110004；3.中國醫科大學附屬盛京醫院先天畸形研究中心實驗室，沈陽110004；4.內蒙古鄂爾多斯市中心醫院腎內科，內蒙古鄂爾多斯017000）

目的觀察骨髓間充質干細胞（MSC）延緩腎纖維化的能力以及可能的機制。方法建立SD大鼠5/6腎切除殘腎模型，尾靜脈注射綠色熒光蛋白標記的MSC，移植后4周觀察腎功能以及腎臟病理的改變，應用免疫組化和免疫印跡方法觀察殘腎組織中CD44、CD68、TGF-β1和α-SMA的表達。結果MSC能夠改善殘腎功能和延緩腎纖維化；MSC不僅減少了巨噬細胞的浸潤和肌成纖維細胞的堆積，而且抑制了CD44和TGF-β1的表達。結論MSC治療能夠延緩腎纖維化，其主要機制可能與其抗炎作用和免疫抑制有關。

骨髓間充質干細胞；5/6腎切除；慢性腎衰竭；腎纖維化

腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進展至終末期腎衰竭的共同通路，因為終末期腎衰竭只能依靠血液凈化治療或腎移植來延緩生命，所以延緩或逆轉腎纖維化對阻止進入終末期腎衰竭具有重大意義，但至今尚無特異有效的治療方法。很多研究都已證實骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）能夠通過不同機制改善和逆轉急性腎臟損傷：減輕管周毛細血管叢的損失，促進腎小管修復［1～3］；減少腎臟細胞凋亡、減少中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，增加抗炎因子的釋放［4～6］。對于MSC是否能夠延緩慢性腎臟病的腎纖維化發生發展，因為基礎疾病的差別而出現研究結果的差異［7～11］。本課題組前期實驗發現大鼠5/6腎切除術后的第8周給予尾靜脈注射MSC能夠改善殘腎功能，故本實驗擬進一步研究MSC延緩殘腎纖維化可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

穩定轉染綠色熒光蛋白的大鼠骨髓間充質干細胞（MSC/GFP）購自廣州賽業生物科技有限公司（RASMX-01101）。成年健康雄性SD大鼠24只，體質量200～250 g。主要試劑包括SD大鼠間質干細胞基礎培養基（廣州賽業，RASMX-03011-440）、10% MSC專用胎牛血清（廣州賽業，RASMX-05001-50）、

小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（博士德試劑有限公司）、兔抗大鼠CD68多克隆抗體（博士德試劑有限公司）、小鼠抗大鼠CD44單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、小鼠抗綠色熒光蛋白標簽單克隆抗體（美國Earth OX公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：MSC/GFP分離來自SD大鼠骨髓，通過腺病毒轉染將綠色熒光蛋白報告基因穩定整合至細胞染色體，能夠持續表達綠色熒光蛋白，而不影響細胞的形態、增殖和分化。MSC/GFP在體外有強烈的增殖和分化能力，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。MSC/GFP在37℃和5%CO2的恒溫箱中進行常規細胞培養。

1.2.2 建立5/6腎切除大鼠模型和實驗動物分組：24只成熟雄性SD大鼠經過適應性飼養1周后隨機分成3組（每組8只）：假手術組（假手術大鼠尾靜脈注射MSC）、模型組（5/6腎切除大鼠尾靜脈注射PBS）、MSC組（5/6腎切除大鼠尾靜脈注射MSC）。根據參考文獻［12］通過二步法進行5/6腎切除術，前后間隔1周，假手術組只給予先后2次麻醉和剝離雙腎被膜，而不進行腎切除。術后第8周尾靜脈注射1 mL PBS或1 mL懸浮1×107MSC的PBS，治療4周后處死大鼠，留取血標本和殘腎組織進行下一步檢查。

1.2.3 腎功能測定：酶法測定血清肌酐濃度，尿素酶法測定尿素氮濃度，檢測儀器為全自動生化儀。

1.2.4 體內MSC的追蹤：應用免疫熒光法進行殘腎組織中的MSC/GFP追蹤，冰凍切片（10 μm），甲醇浸泡30 min，滴加小鼠抗綠色熒光蛋白標簽單克隆抗體（1∶5 000）4℃過夜，避光滴加FITC標記山羊抗小鼠IgG（1∶50），DAPI復染核5 min，共聚焦顯微鏡觀察所有非連續切片的所有綠色熒光蛋白陽性的部位。

1.2.5 組織形態學觀察：常規進行HE和Masson染色后，每張切片均觀察30個腎小球和20個100倍的皮質視野，根據盲法原則由另外病理醫師完成，采用半定量方法計算小球硬化指數［13］和小管間質損傷指數［14］，腎小球硬化定義為局灶或球性毛細血管袢的閉塞或玻璃樣，腎小管間質損傷的定義為炎性細胞浸潤、小管萎縮/代償性擴張和間質纖維化。

1.2.6 免疫組化：石蠟切片（4 μm），脫蠟，熱修復，5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗：小鼠抗大鼠α-SMA抗體（肌成纖維細胞標記，1∶320）、小鼠抗大鼠TGF-β1抗體（1∶200）、兔抗大鼠CD68抗體（巨噬細胞標記，1∶150），小鼠抗大鼠CD44單克隆抗體（1∶200）按ABC法進行免疫組化染色，DAB顯色；PBS替代一抗作為陰性對照。每張切片隨機取10個高倍視野（×400），計算積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.2.7 免疫印跡：稱取100 mg殘腎腎皮質，提取總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度，變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，不同的轉移膜分別加入不同一抗［小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（1∶160）、小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體（1∶200）、小鼠抗大鼠CD44單克隆抗體（1∶300）和兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶2 000）］4℃過夜，加入相應的二抗，ECL顯色發光，圖像分析系統測定光密度值。

1.3 統計學處理

結果用x±s表示。應用SPSS 13.0統計軟件對數據進行處理。組間數據比較用單因素方差分析，進一步用LSD進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSC的體內追蹤

體外培養MSC持續發出綠色熒光，應用MSC治療4周后，在殘腎組織中發現綠色熒光蛋白標記的MSC，主要定位于腎小球內、腎小管上皮細胞，腎間質以及腎小管管周毛細血管叢內。見圖1。

圖1 腎組織中追蹤綠色熒光蛋白標記的MSC×400Fig.1 Tracking of GFP labeled MSC in kidney tissue by immunofluorescence×400

2.2 MSC治療5/6腎切除后殘腎的功能和病理的變化

與假手術組比較，模型組大鼠的血清肌酐和尿素均明顯升高（P＜0.05），而與模型組比較，MSC治療組的殘腎功能明顯改善，HE和Masson染色結果發現，模型組的殘腎組織出現廣泛的腎小球明顯肥大、部分腎小球出現節段性硬化或全球硬化、腎小管上皮細胞濁腫空泡變性，部分腎小管出現明顯的

擴張或萎縮；大量的炎性細胞浸潤，腎間質灶性間質水腫或纖維化，MSC治療組的病理改變明顯改善。進一步計算發現MSC能夠有效減少腎小球硬化指數和腎小管間質損傷指數（P＜0.05），見表1，圖2、3。

圖2 腎組織的HE染色×400Fig.2 HE staining in kidney tissue×400

圖3 腎組織的Masson染色×400Fig.3 Masson staining in kidney tissue×400

2.3 MSC治療后CD44、CD68、TGF-β1和α-SMA的表達變化（圖4～7、表2）

2.3.1 免疫組化：與假手術組比較，5/6腎切除術后在殘腎組織腎小球和腎間質內有大量的巨噬細胞浸潤（CD68陽性細胞）和肌成纖維細胞（α-SMA陽性細胞）堆積，同時腎小球明顯表達CD44和TGF-β1。給予MSC治療4周后不僅CD44、和TGF-β1的表達減少，而且巨噬細胞和肌成纖維細胞也明顯減少（P＜0.05）。

2.3.2 免疫印記：5/6腎切除術后，殘腎組織的CD44、TGF-β1和α-SMA的蛋白表達明顯升高，而給

予MSC治療4周后，TGF-β1、α-SMA和CD44的蛋白表達均減少（P＜0.05）。

圖4 腎組織中CD68的免疫組化染色×400Fig.4 CD68 immunohistochemistry staining in kidney tissue× 400

圖5 腎組織中CD44的免疫組化染色（×400，左圖）和免疫印跡（右圖）Fig.5 CD44 immunohistochemistry staining in kidney tissue（×400，left）and Western blot for CD 68（right）

圖6 腎組織中TGF?β1的免疫組化染色（×400，左圖）和免疫印跡（右圖）Fig.6 TGF?β1 immunohistochemistry staining in kidney tissue（×400，left）and Western blot for TGF?β1（right）

圖7 腎組織中α?SMA的免疫組化染色（×400，左圖）和免疫印跡（右圖）Fig.7α?SMA immunohistochemistry staining in kidney tissue（×400，left）and Western blot for α?SMA（right）

表1 MSC治療對腎功能和腎臟組織參數的影響Tab.1 Effect of MSC treatment on renal function and histological parameters

表1 MSC治療對腎功能和腎臟組織參數的影響Tab.1 Effect of MSC treatment on renal function and histological parameters

1）P＜0.05 vs sham group；2）P＜0.05 vs 5/6 Nx group.

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表2 各組CD44、CD68、TGF-β1和α-SMA表達的比較Tab.2 Comparisons the expression of CD44,CD68,TGF-β1 andα-SMA in each group（x±s）

表2 各組CD44、CD68、TGF-β1和α-SMA表達的比較Tab.2 Comparisons the expression of CD44,CD68,TGF-β1 andα-SMA in each group（x±s）

1）P＜0.05 vs sham group；2）P＜0.05 vs 5/6 Nx group.

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3 討論

目前關于MSC治療各種慢性腎臟病的研究較少，而且研究結果并不一致，眾多研究者［7～9］應用MSC治療慢性馬兜鈴酸腎病大鼠后，發現管周毛細血管叢得到修復，腎小管萎縮及腎間質纖維化程度明顯減輕；Ninichuk等［10］在Col4α3缺乏的大鼠模型中的研究中發現MSC雖然能夠減少管周毛細血管叢的丟失，減少纖維化，但并未改善腎臟功能，增加存活率；Kunter等［11］發現MSC雖然改善抗-Thy1.1腎小球腎炎的腎功能，但是發現部分歸巢的MSC分化為脂肪細胞，反而促進腎纖維化的發生。分析引起這種現象的可能原因之一是與腎臟病的原發病不同有關。本研究選擇大鼠5/6腎切除做為研究模型，是因為其模擬了各種病因引起的大量腎單位的喪失后共同出現的殘余腎單位高灌注、高濾過和高壓（三高）病理生理改變，所以其最終腎臟纖維化的發生與發展與原發病無關。

與Villanueva等［15］的研究結果相似，本試驗發現5/6腎切除術后出現了明顯的腎臟病理改變，即殘存腎單位的腎小球肥大，腎小管擴張，炎性細胞浸潤，局灶性的腎小球硬化和腎間質纖維化，而給予MSC治療4周后，不僅腎功能得到改善，而且上述病理改變也明顯減輕。定量指標腎小球硬化指數和腎小管間質損傷指數的明顯降低也進一步支持MSC能夠延緩殘腎組織的纖維化。

目前大部分研究證實MSC能夠修復受損腎臟的機制可能包括轉分化、融合或旁分泌機制。體內外研究證實MSC可以分化為血管內皮細胞［8］、腎小管上皮細胞［16］和足細胞［17］，我們的實驗結果提示，綠色熒光蛋白在部分腎小管上皮細胞和腎小球球內細胞表達，那么推測歸巢的MSC可能融合或轉分化為腎臟固有細胞，但是與目前大多數研究的結果相似，本研究在給予尾靜脈注射1×107MSC治療4周后，歸巢的MSC比例較少，那么推測MSC可能主要是通過旁分泌機制來延緩腎纖維化。各種原因導致的慢性腎臟病，即使病因去除，健存腎單位仍會進一步喪失功能，其主要原因是殘存腎單位腎小球出現“三高”引起炎性細胞浸潤，分泌炎癥相關因子和致纖維化因子，腎臟固有細胞的表型轉化，大量細胞外基質的堆積，最終導致腎纖維化的發生。本研究中，我們發現在殘腎組織中大量巨噬細胞（CD68陽性細胞）的浸潤，致纖維化因子TGF-β1的明顯表達以及肌成纖維細胞（α-SMA陽性細胞）的大量出現，給予MSC治療后，與既往的研究結果類似［18，19］，CD68、TGF-β1和α-SMA的表達均明顯減少，

同時腎小球硬化指數和腎小管間質損傷指數明顯降低，這提示MSC可能通過抗炎和免疫抑制等旁分泌機制來延緩腎纖維化。

本研究還發現殘腎組織中CD44的表達也明顯增加，既往認為CD44在急慢性腎臟損傷中是導致炎性細胞浸潤的重要原因［20，21］，因為敲除CD44基因的小鼠在甘油誘導和缺血再灌注損傷導致的急性腎衰竭模型中均能通過減少早期炎性細胞浸潤從而減輕腎臟損傷［1］。本研究中，模型組大鼠的腎小球內CD68和CD44表達均明顯增加，提示CD44與腎小球內的巨噬細胞浸潤可能有關。本次研究發現給予MSC治療后，殘腎組織的CD44表達也減少，那么推測MSC有可能通過減少CD44的表達而減輕巨噬細胞的浸潤，但MSC減少CD44的機制并不明確，需要進一步研究。

綜上所述，我們的研究表明MSC能夠延緩5/6腎切除術后殘腎組織的纖維化，改善腎功能，其主要的機制可能是通過旁分泌機制減輕炎性細胞（如巨噬細胞）浸潤，減少致纖維化因子（如TGF-β1）表達，從而減輕上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞，最終延緩腎纖維化的發生和發展。

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（編輯 武玉欣）

MesenchymalStem CellAttenuate RenalFibrosisin RatRemnant Kidney Model

BIANXiao-hui1，2，ZHAOGui-feng3，SUNLi1，LIUNa4；LIDe-tian2；FENGJiang-min1
（1.DepartmentofNephrology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofNephrology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Key Laboratory of Health Ministry for Congential Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；4.Departmentof Nephrology，The CentralHospitalofOrdos City，Ordos017000，China）

ObjectiveTo investigate the role of mesenchymal stem cells（MSC）therapy in renal fibrosis and explore the mechanism.MethodsRemnant kidney model was established by 5/6 nephrectomy in Sprague-Dawley rats，and the animals received MSC treatment via tail vein injection. Renal function and histological analysis were performed 4 weeks after cell transplantation.Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of CD44，CD68，TGF-β1 and α-SMA.ResultsThe functional benefits of MSC treatment were demonstrated by improved clinical signs and reduced fibrosis formation.The infiltration of macrophages and the accumulation of myofibroblasts were reduced after MSC treatment. The levels of TGF-β1 and CD44 were also decreased in MSC treated groups.ConclusionMSC therapy can attenuate fibrosis progression in remnantkidney model.Moreover，the anti-inflammatory and immunosuppressive potentialofMSCmay be involved in the decreased fibrosis in kidney.

mesenchymal stem cell；5/6 nephrectomy；chronic renal failure；kidney fibrosis

R692.5；R457.7

A

0258-4646（2014）02-0131-05

遼寧省自然科學基金（20072095）；遼寧省社會發展攻關計劃（201225094）

邊曉慧（1976-），女，講師，碩士.

馮江敏，E-mail：fengjiangmin@hotmail.com

2013-11-27

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