阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注保護作用的實驗研究

杜萍，常棟，陳暢

（大連醫科大學附屬第一醫院1.心內科；2.急診科，遼寧大連116011）

阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注保護作用的實驗研究

杜萍1，常棟1，陳暢2

（大連醫科大學附屬第一醫院1.心內科；2.急診科，遼寧大連116011）

目的研究阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法54只SD大鼠隨機分為3組：阿托伐他汀組（n= 18）、缺血再灌注組（n=18）和假手術組（n=18）。制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，從阿托伐他汀組和缺血再灌注組各選取8只小鼠進行Evans blue和TTS染色，應用圖像分析軟件計算梗死的面積，制備大鼠心肌組織勻漿，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量，酶聯免疫（ELISA）法測定腫瘤壞死因子α（TNF-α）及髓過氧化物酶（MPO）含量。于術后14 d檢測剩余30只大鼠的血流動力學指標及心室重構指標，并對結果進行統計分析。結果阿托伐他汀干預組大鼠與再灌注組比較，心肌梗死面積小于缺血再灌注組，缺血未梗死面積大于缺血再灌注組，心肌梗死面積占缺血總面積的比例小于缺血再灌注組。與假手術組比較，缺血再灌注組及阿托伐他汀組MDA、TNF-α和MPO均增加，但阿托伐他汀組增加較少。血流動力學及左心室功能較缺血再灌注組明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論阿托伐他汀可減小心肌缺血再灌注后損傷的梗死面積，改善血流動力學及左心室功能。

阿托伐他汀；心肌缺血；再灌注損傷

心肌梗死后，通過溶栓或經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及早恢復心肌灌注是減小心肌梗死面積、改善臨床預后的重要手段。然而，缺血心肌血流恢復可能引起心肌缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），從而降低了心肌再灌注的療效。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑，通常用于調節血脂，降低血漿膽固醇和脂蛋白水平。近年來的研究發現，該類藥物具有多種心血管保護功能［1，2］。本研究采用大鼠心肌缺血再灌注模型，研究阿托伐他?。╝torvastatin）對心肌的保護作用，以期為深入研究及臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥方法

選取6～8周齡的清潔級SD大鼠54只（由大連醫科大學實驗動物中心提供），雌雄各半，體質量180～250 g。隨機分為3組：阿托伐他汀組（n=18）：于術前1周開始以15 mg/kg的阿托伐他汀與2 mL生理鹽水混勻灌胃；缺血再灌注組（n=18）和假手術組（n= 18）：均用2 mL生理鹽水每日1次灌胃。術前均禁食12 h。設立假手術組旨在消除飼養條件、鹽水灌胃及常規手術操作對實驗效果的影響。

1.2 大鼠心肌缺血再灌注模型的制備

腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉大鼠，將頭部及四肢固定于操作臺。連接心電圖機，采用標準導聯。自左側3、4肋間打開胸腔，阿托伐他汀組及缺血再灌注組于肺動脈圓錐及左心室間左心耳下2～3 mm處分離并結扎冠狀動脈左前降支，假手術組只分離不結扎。觀察到心跳變緩，心肌呈暗紅色，心電圖ST段抬高和（或）T波高聳即表示結扎成功［3］。將心臟歸位并計時30 min，再次取出心臟，解除結扎線，再灌注3 h。

1.3 心肌梗死面積的測定

再灌注3 h后，各組分別取大鼠8只，其中阿托伐他汀組及缺血再灌注組共16只大鼠開胸并于原位置進行結扎，經心尖部注入3 mL Evans blue（10 g/L）進行染色。處死大鼠并迅速摘除心臟，用生理鹽水洗凈，剪除心房、右心室及大血管，沿長軸切成2 mm的薄片5片，浸入TTC磷酸緩沖溶液（0.5 mg/mL，pH7.4）中。37℃孵育30 min進行染色［4］。經TTC和Evans blue雙染色，心肌組織分成3部分:藍染部分（即Evans blue染色部分）為正常心肌組織，紅染部分（即TTC染色部分）為缺血未梗死心肌組織，灰白色部分為缺血梗死心肌組織。拍照并應用圖像分析軟件計算各部分的面積。

1.4 缺血非梗死區心肌組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量的測定

取大鼠左心室缺血未梗死區域的心肌組織0.7～1.0 g（假手術組取相同位置），加裂解液、生理鹽水混勻，應用Omni Prep自動組織均漿儀制備10%組織勻漿，低溫低速離心機3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定MDA含量，酶聯免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定TNF-α及MPO含量，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 相關指標的檢測

1.5.1 血流動力學指標檢測：于術后14 d測量剩余大鼠的心率（heart rate，HR）、主動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、主動脈舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、左心室收縮期壓力（left bentricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末期壓力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室內壓上升最大速率（+dp/dt）及左心室內壓下降最大速率（-dp/dt）。

1.5.2 心室重構指標檢測：測量大鼠體質量后處死，開胸分離心臟，分別測量左右心室的質量并計算其相對質量（左右心室相對質量=左右心室質量/體質量），同時測量室間隔厚度。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料均采用表示。2組之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用方差分析。計數資料及構成比之間差異的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌梗死面積測量結果

阿托伐他汀組大鼠心肌梗死面積小于缺血再灌注組，缺血未梗死面積大于缺血再灌注組，差異有統計學意義（P＜0.05）；阿托伐他汀組缺血總面積（即梗死面積與缺血未梗死面積之和）小于缺血再灌注組，差異無統計學意義（P＞0.05）；阿托伐他汀組大鼠心肌梗死面積占缺血總面積的比例小于缺血再灌注組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 阿托伐他汀組與缺血再灌注組心肌梗死面積比較Tab.1 Myocardial infarct size of atorvastatin group and ischemia reperfusion group

2.2 MDA、TNF-α、MPO含量測定結果

相較于假手術組，缺血再灌注組及阿托伐他汀組MDA、TNF-α和MPO均增加，差異有統計學意義（P均＜0.05）。與缺血再灌注組比較，阿托伐他汀組MDA、TNF-α和MPO均減少，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠MDA、TNF?α及MPO測定結果比較Tab.2 MDA，TNF?αand MPO levels of all groups

2.3 血流動力學測量結果

與假手術組比較，缺血再灌注組HR增加，SBP、DBP、+dp/dt、-dp/dt及LVSP下降，LVEDP升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組比較，阿托伐他汀組HR降低，SBP、DBP、+dp/dt、-dp/dt及LVSP升高，LVEDP下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血流動力學測量結果比較Tab.3 Comparison of cerebral vascular hemodynamics index of all groups

2.4 心室重構測量結果

各組大鼠體質量無顯著差異（P＞0.05），與假手術組比較，缺血再灌注組的左右心室相對重量較大、室間隔厚度較寬，其差異經檢驗均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與缺血再灌注組比較，阿托伐他汀組的左右心室相對質量較小、室間隔厚度較窄，其差異經檢驗均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠心室重構測量結果比較Tab.4 Comparison of ventricular remodeling of all groups

3 討論

他汀類藥物是目前使用廣泛的調脂藥物。研究表明，他汀類藥物可降低心肌缺血再灌注術后心肌損傷的水平，改善遠期預后［2，5］。本研究結果顯示，阿托伐他汀干預組大鼠與單純再灌注組相比，缺血總面積并無差異，但其心肌梗死面積小于缺血再灌注組，缺血未梗死面積大于缺血再灌注組，心肌梗死面積占缺血總面積的比例小于缺血再灌注組，差異有統計學意義，與Post等［6］的研究結果一致。提示阿托伐他汀可能會使心肌梗死的面積減小，從而減輕再灌注造成的傷害，而并不是通過減小缺血面積發揮保護作用。

自由基顯著增高與心肌缺血再灌注術后損傷有密切聯系。MDA作為脂質過氧化物的終產物，測定其含量能反映氧自由基損傷程度。本研究結果顯示，與假手術組比較，缺血再灌注組與阿托伐他汀組的MDA均增高，但阿托伐他汀組增加較缺血再灌注組少，與余慧等［7］的研究結果一致。TNF-α是一種重要的炎性細胞因子，可通過促進氧自由基生成、活化中心粒細胞誘導心肌細胞凋亡等途徑加重IRI。Dong等［8］的研究發現，心肌缺血再灌注后大鼠TNF-α含量顯著增高，本研究結果與之一致，但同時也顯示應用阿托伐他汀干預的大鼠TNF-α增高較少。中性粒細胞活化在IRI中有重要作用，MPO作為其標志物，與炎性反應時氧化應激與組織損傷繼而導致IRI有密切關系［9］。本研究結果顯示，缺血再灌注組與阿托伐他汀組的MPO均增高，但阿托伐他汀組的MPO增高較缺血再灌注組少。

本研究結果顯示，應用阿托伐他汀可改善包括SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左心室內壓上升最大速率及左心室內壓下降最大速率等多項血流動力學指標，這與劉宗武等［10］的研究結果一致。對心室重構的測量結果顯示，應用阿托伐他汀可有效抑制缺血再灌注后的左心室擴張，改善左心室功能，減輕再灌注造成的心肌損傷。其他動物研究結果表明，阿托伐他汀的保護作用可能與修復損傷的內皮細胞［11］、促進線粒體ATP敏感性鉀通道開放［12］及調控一氧化氮生成［13］等因素有關，但其機制尚不明了，有待進一步研究。

綜上所述，阿托伐他汀可影響心肌缺血再灌注后損傷的梗死面積，改善血流動力學及左心室功能，這為進一步研究他汀類藥物治療心肌IRI提供了重要的理論依據。

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（編輯 王又冬）

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Protective Effectsof Atorvastation on Myocardium Ischemia Reperfusion Injury in Rats

DUPing1，CHANGDong1，CHENChang2
（1.DepartmentofCardiology，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China；2.DepartmentofEmergency，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects of atorvastation on myocardium ischemia reperfusion injury in rats.MethodsA total of 54 SD rats were randomized into three groups：atorvastatin group（n=18），ischemia reperfusion group（n=18），and sham-operated group（n=18）；the rat model of myocardial ischemia-reperfusion was established，and 8 rats were sacrificed from atorvastatin group and ischemia reperfusion group for Evans blue and TTS staining.Myocardial infarct size of the16 rats were analyzed using image processing software.The level of malondialdehyde（MDA）were measured by thiobarbituric acid method（TBA）；tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）and myeloperoxidase（MPO）were determined by enzyme-linked immunoadsordentassay（ELISA）.14 daysafterthe operation，the hemodynamic parameters and ventricularremodeling ofremaining 30 ratswere measured.ResultsMyocardialinfarctsize ofatorvastatin group waslowerthan ischemia reperfusion group；compared with the sham -operated group，the level of MDA，TNF-α and MPO were increased in both ischemia reperfusion group and atorvastatin group，but rate of increase is lower in atorvastatin group than ischemia reperfusion group；the hemodynamic parameters and ventricular remodeling of rats were significantly improved，all the differences were all significant（P＜0.05）.ConclusionAtorvastatin can reduce the myocardial infarct size，improve the hemodynamic parameters and ventricularremodeling in ratmyocardium ischemia-reperfusion injury.

atorvastatin；myocardial ischemia；reperfusion injury

R542.22

A

0258-4646（2014）05-0407-04

國家自然科學基金（81200136）

杜萍（1980-），女，主治醫師，碩士研究生.

陳暢，E-mail：xyxchang@hotmail.com

2014-02-25

網絡出版時間：