細(xì)菌ZY-H產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

, ,,*,, ,高寧

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅張掖 734000;2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅張掖 734000;3.河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,甘肅張掖 734000)

靈菌紅素是一種脂溶性天然色素,是由粘質(zhì)沙雷氏菌、假單胞菌、嗜冷紅弧菌[1-2]、真細(xì)菌[3]所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,該色素具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等多種生物活性[4-6],同時(shí)對(duì)海洋赤潮藻具有清除作用[7-8]。因此,靈菌紅素在醫(yī)藥、環(huán)境治理和食品上具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)靈菌紅素的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了大量的研究[1,3,9-12],但是由于產(chǎn)靈菌紅素菌的分離源不同,發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成差異較大,代謝產(chǎn)物也不盡相同[13],這就限制了靈菌紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

基于此,本研究從河西走廊張掖境內(nèi)采集的蘆葦根系土壤中分離出一株產(chǎn)靈菌紅素的細(xì)菌[14],通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)探討了pH、溫度、發(fā)酵時(shí)間、碳源、氮源等參數(shù)對(duì)細(xì)菌ZY-H產(chǎn)靈菌紅素的影響,以期為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)室從張掖地區(qū)蘆葦根系周?chē)耐寥乐蟹蛛x到產(chǎn)靈菌紅素的菌株,編號(hào)為ZY-H;蔗糖、CaCl2、95%乙醇、鹽酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純;蛋白胨、牛肉膏 均為國(guó)產(chǎn)生化試劑;X-5大孔吸附樹(shù)脂、硅膠(200～300目) 南開(kāi)大學(xué)化工廠;斜面培養(yǎng)基[15]蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15～20g/L,pH7.2～7.5;種子擴(kuò)大培養(yǎng)基 同斜面培養(yǎng)基,其他成分相同,不加瓊脂;PDA培養(yǎng)基 參考文獻(xiàn)[15];液體發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L,pH7.2～7.5。

760CRT雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AE200電子分析天平 Mettler Toledo公司;CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;VA1-2真空干燥箱 美國(guó)Shellab公司;HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A 鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司;DHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵 鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司;層析柱(15cm×30cm) 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素的提取與制備

1.2.1.1 色素的生產(chǎn)和提取工藝

1.2.1.2 菌體培養(yǎng) 從斜面培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)液中,32℃、180r/min恒溫培養(yǎng)12～16h,以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,在32℃、180r/min恒溫培養(yǎng)48h;合并發(fā)酵液,在12000r/min離心10min,收集紫紅色菌體。

1.2.1.3 色素的提取 在菌體中加入95%乙醇浸提至菌體無(wú)色,離心,上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮,真空干燥,然后根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行純化、分離。

1.2.2 靈菌紅素的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取純化的色素粉末20mg,用酸性乙醇溶解并定容至10mL,準(zhǔn)確吸取0.5mL用酸性乙醇稀釋至10mL即為0.1mg/mL的色素母液。吸取色素母液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL用酸性乙醇定容至10mL,在533nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),靈菌紅素的濃度為橫坐標(biāo)作圖。

1.2.2.2 色素的測(cè)定 取1mL發(fā)酵液于4℃,10000r/min離心10min,棄上清,菌體中加入5mL酸性乙醇(95%乙醇∶1moL/L鹽酸=24∶1)提取色素直至菌體無(wú)色,在4℃,10000r/min離心10min。將色素液定容至10mL,然后用酸性乙醇稀釋后在533nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程,計(jì)算每升發(fā)酵液所含靈菌紅素的含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在是先預(yù)做的單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)影響靈菌紅素產(chǎn)量的培養(yǎng)基組成碳源、氮源、氯化鈣以及影響發(fā)酵條件的發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時(shí)間、溫度、裝液量和接種量做正交設(shè)計(jì),因素水平表見(jiàn)表1,表2。

表1 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for culture medium

根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以靈菌紅素為考察指標(biāo),確定發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量影響的最優(yōu)組合。

1.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果,對(duì)最佳優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行重復(fù)5次發(fā)酵實(shí)驗(yàn),以菌體濃度和靈菌紅素含量為衡量指標(biāo),并與馬鈴薯(PDA)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行比較,來(lái)驗(yàn)證最佳發(fā)酵參數(shù)的可行性。

表2 發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation condition

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行處理,Origin7.5軟件作圖,DPS12.5軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈菌紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

靈菌紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,以吸光度為縱坐標(biāo),靈菌紅素的濃度為橫坐標(biāo)作圖并建立回歸方程y=0.066x+0.009,R2=0.9994,y代表吸光度,x是色素的濃度(μg/mL)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)條件下靈菌紅素的產(chǎn)量。

圖1 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 Standard curve of prodigiosins

2.2 發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)影響靈菌紅素產(chǎn)量的蔗糖、蛋白胨、氯化鈣為主要因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),測(cè)定發(fā)酵液中靈菌紅素的含量,其結(jié)果與方差分析見(jiàn)表3、表4。

從表3可以看出,2號(hào)實(shí)驗(yàn)組合,靈菌紅素的含量最高,由極差分析可知,在發(fā)酵培養(yǎng)基中影響靈菌紅素含量的因素主次順序?yàn)?B>C>A,即蛋白胨影響最大,其次為氯化鈣,蔗糖影響最小。研究表明,F值越大,該因素影響越顯著,由表4方差分析表明,三因素中蛋白胨對(duì)靈菌紅素影響顯著(p<0.05),其它兩種因素影響不顯著。綜合極差和方差分析,ZY-H菌株產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A1B2C2,即蔗糖為10g/L、蛋白胨15g/L、氯化鈣為0.025mol/L,在28℃,180r/min恒溫培養(yǎng)48h,靈菌紅素含量最高,達(dá)到21.53 g/L。

2.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 在培養(yǎng)基固定的條件下,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)影響靈菌紅素的發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時(shí)間、溫度、裝液量和接種量進(jìn)行L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以發(fā)酵液中靈菌紅素的含量作為衡量指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表5、表6。

表3 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Data of orthogonal test for culture medium

表4 培養(yǎng)基的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal array for culture medium

由表5極差分析可以看出,各因素對(duì)靈菌紅素含量影響的主次順序?yàn)闀r(shí)間>溫度>接種量>pH>裝液量,發(fā)酵時(shí)間影響最大,溫度次之,裝液量影響最小。從表6方差分析可以看出,4因素均不顯著(p>0.05);從F值的大小看出,發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量影響較大,pH影響較小。綜合分析,細(xì)菌ZY-H產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵條件最佳組合為A4B2C2D4E1,即發(fā)酵時(shí)間48h,溫度28℃,pH6,接種量4%,裝液量為30mL/250mL。

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 對(duì)優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行重復(fù)5次實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在蔗糖為10g/L、蛋白胨為15g/L、氯化鈣為0.025mol/L時(shí),調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH6,接種量為4%,裝液量為30mL/250mL,在溫度為28℃,180r/min培養(yǎng)48h時(shí),發(fā)酵液中靈菌紅素的平均含量為28.37g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基與PDA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2。從圖2可以看出,優(yōu)化后的培養(yǎng)基與PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基相比較,產(chǎn)靈菌紅素分別為28.37、1.45、0.87g/L,優(yōu)化后培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的19.57、43.11倍,且差異極顯著(p<0.01),菌體濃度的變化趨勢(shì)與靈菌紅素的變化相一致。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在同一條件下,發(fā)酵液的顏色變化較大,PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基發(fā)酵液用酸性乙醇浸提后呈淡紅色,優(yōu)化培養(yǎng)基顏色很深,說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基和條件有利于細(xì)菌ZY-H產(chǎn)生靈菌紅素。

表5 發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 5 Data of orthogonal test for fermentation condition

表6 正交設(shè)計(jì)方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal array for fermentation condition

圖2 不同條件下菌體濃度和靈菌紅素的比較 Fig.2 Comparison of cell concentration and producing prodigiosin in different conditions

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化法探討了影響細(xì)菌ZY-H產(chǎn)靈菌紅素的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件。培養(yǎng)基組分配比和發(fā)酵條件的不同可以顯著影響代謝物質(zhì)的產(chǎn)量[16]。目前,關(guān)于靈菌紅素的研究大多集中在抗癌、免疫抑制等性能上,對(duì)于篩選高產(chǎn)菌株及發(fā)酵參數(shù)的研究也有大量報(bào)道,吳歡歡等人[17]在花生粉基本培養(yǎng)基中添加小麥粉和二甲亞砜靈菌紅素達(dá)到5.8g/L,是目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的最高水平;李子武等人[18]報(bào)道Serratia marcescens JNB5-1菌以蔗糖(20g/L)和牛肉膏(15g/L)分別為碳源和氮源,添加脯氨酸、硫酸鎂和硫酸亞鐵,靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)到4.139g/L;Venil,C. K.等人[3]報(bào)道Serratia marcescens SWML08菌以磷酸銨作為氮源,乳糖作為碳源,添加微量元素,靈菌紅素為1.394g/L;Helvia W 等人[19]采用木薯廢液甘露醇培養(yǎng)基發(fā)酵液中靈菌紅素達(dá)到49.5g/L,雖然色素產(chǎn)量很高,但要受到原料的季節(jié)性限制;而本研究細(xì)菌ZY-H以蔗糖、蛋白胨為碳源和氮源,添加0.025mol/L的氯化鈣,發(fā)酵液中靈菌紅素含量達(dá)到21.53g/L,優(yōu)化培養(yǎng)基與上述文獻(xiàn)相比較簡(jiǎn)單易得,不受原料的限制,可以應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中;Robert P. Williams等人[20]研究了溫度對(duì)Serratia marcescen產(chǎn)靈菌紅素的影響,發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)靈菌紅素的產(chǎn)量有顯著影響;牛燕等人[11]研究海洋細(xì)菌S-9801產(chǎn)靈菌紅素的最佳條件為pH5、溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間為48h,此時(shí)發(fā)酵液中靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)到30mg/L,本研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵液初始pH6,接種量為4%,裝液量30mL/250mL(即12%的裝液量),在溫度為28℃,180r/min培養(yǎng)48h時(shí),靈菌紅素的含量達(dá)到28.37g/L,分別是PDA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的19.57,43.11倍。通過(guò)以上比較分析,ZY-H菌產(chǎn)靈菌紅素的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單,發(fā)酵周期較短,靈菌紅素的產(chǎn)量高,適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本研究對(duì)分離到的一株細(xì)菌ZY-H產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考,但是要應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中,后續(xù)要對(duì)放大參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化;菌株進(jìn)行分子鑒定以確定其歸屬;并采用誘變、分子生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)行改造以進(jìn)一步提高靈菌紅素的表達(dá)量。

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