銀杏葉提取物后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用的研究

鄧永超 劉煜敏

缺血性腦血管病尤其是腦缺血后的再灌注損傷對人類健康危害較大。研究表明藥物后處理可產生與缺血后處理類似的腦保護作用，因藥物后處理可操作性強，更具有臨床意義。已經證實銀杏提取物EGb761對中樞神經系統有一定的保護作用［1］。腦組織微管相關蛋白（MAP2）作為神經細胞的骨架成分，參與神經元的生長和損傷后的修復過程，同時對缺血也極其敏感［2］。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，并用銀杏葉提取物進行后處理，然后觀察缺血再灌注腦組織中MAP2的表達水平來探討銀杏葉提取物對神經的保護作用及其機制，為其治療腦缺血再灌注損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏葉提取物（EGb761）（德國Schwade制藥公司）；Western Blotting Ecl試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）；兔抗鼠MAP2多克隆抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔多克隆抗體（美國Cell Singling公司）。

1.2 動物分組與模型建立

健康雄性SD大鼠30只，體重300～320 g，由武漢大學動物中心提供。實驗前禁食12 h，自由飲水，采用隨機數字表法，將其隨機分為3組，即假手術組（n＝10）：給予5 ml生理鹽水腹腔注射；對照組（n＝10）：缺血90 min，再灌注24 h，5 ml生理鹽水腹腔注射；實驗組（n＝10），缺血90 min，再灌注24 h，在再灌注即刻大鼠腹腔注射20 mg／kg銀杏葉提取物稀釋5 ml。

采用線栓（Longa）法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型［3］。經腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）實施麻醉，每隔90 min追加注射20 mg／kg；頸部備皮、消毒，取頸正中切口，暴露和游離右側頸總動脈，并置入尼龍線栓，經動脈分叉推送線栓進入頸內動脈，遇到阻力明顯表明線栓頭端已阻斷大腦中動脈，阻斷90 min，再灌注24 h。

1.3 指標測定

1.3.1 于再灌注24 h后進行神經功能缺損評分（NDS）［3］：0級，無神經功能缺損癥狀；1級，輕度局灶性神經功能缺損，即提尾懸空時不能伸展左前肢；2級，中度局灶性神經功能缺損，即行走時向左側偏轉；3級，重度局灶性神經功能缺損，即行走時向左側傾倒；4級，昏迷，不能自行行走。

1.3.2 大鼠腦組織－20℃冷凍30 min，冠狀位切割成厚度為2 mm的薄片，經1%TTC染色20 min，10%甲 醛 固 定24 h。采 用Image－Pro Plus 5.02圖像分析軟件計算腦梗死體積（測定的腦梗死體積／同側大腦半球體積×100%）。

1.3.3 采用蛋白印跡分析技術測定缺血側和健側腦組織MAP2表達水平 取大鼠腦缺血側和對側組織標本，全層皮質稱重，每100 mg腦組織加1 mL裂解液制備組織勻漿，離心取上清液定量。經電泳和轉膜后進行封閉和雜交，一抗為兔抗大鼠MAP2抗體（1∶1000）孵育1 h，二抗為辣根過氧化酶標記的山羊抗兔多克隆抗體（1∶1000）孵育1 h，采用辣根過氧化物酶HRP－ECL發光法進行顯色。采用Image—Pro Plus 5.02圖像分析軟件對上述顯影的X線片做圖像灰度掃描，將假手術組腦組織MAP2蛋白條帶灰度的平均數設為正常值，各組腦組織MAP2表達水平以其蛋白條帶灰度值與正常值的百分比表示。

1.4 統計學處理

所有數據均在SPSS13.0統計軟件分析。計量資料用均數±標準差（ˉx±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠NDS評分

假手術組、對照組和實驗組大鼠NDS評分分別為（0.18±0.05）分、（2.49±0.85）分 和（1.58±0.62）分，對照組和實驗組NDS評分較假手術組均顯著升高，實驗組NDS評分較對照組明顯下降，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠腦梗死體積比較

與假手術組比較，對照組、實驗組腦梗死體積均顯著增大；與對照組比較，實驗組腦梗死體積顯著減小，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠腦梗死體積與同側大腦半球體積的比值比較（ˉx±s，n＝5，%）

2.3 3組大鼠腦組織MAP2蛋白的表達水平

與假手術組比較，對照組、實驗組缺血側MAP2蛋白的表達水平均顯著降低；與對照組比較，實驗組缺血側MAP2蛋白的表達水平顯著升高，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠MAP2蛋白表達水平的比較（ˉx±s，n＝5，%）

3 討 論

機體組織器官正常代謝、功能的維持依賴于良好的血液供應。現如今腦血管病是臨床首位致殘因素，其中缺血性腦血管病約占全部腦卒中的70%。缺血性腦血管病尤其是缺血后的再灌注損傷對人類健康危害較大。研究表明缺血后處理和預處理一樣，可以通過減少氧自由基途徑而有效減輕缺血再灌注損傷，尤其在早期，而且比預處理更有效調控［4，5］。藥物后處理作為其重要方式，以其無創優點顯示出更好的前景。王小姍等人采用銀杏提取物EGb761混合處理后發現其具有腦缺血保護作用［6］。故本研究采用銀杏提取物EGb761后處理來探討其腦保護作用及其機制。

本實驗結果表明大鼠腦缺血再灌注損傷予以銀杏提取物EGb761處理后明顯降低NDS評分，改善大鼠腦梗死后的神經功能癥狀。微管相關蛋白2（MAP2）是神經細胞的骨架成分，在大鼠的神經元中表達豐富，MAP2參與神經元的生長和損傷的修復過程，對缺血相當敏感［7，8］。MAP2表達增強則有助于維持神經元結構的完整性，是神經元的保護反應，提示神經元對傷害性刺激耐受性提高，這可能與NMDA受體活性相關［8］。MAP2減少被認為是缺血神經元Ca2＋內流增加、激活鈣調蛋白水解酶和水解細胞骨架蛋白的結果［9］。本研究結果表明經銀杏葉提取物EGb761后處理后能明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經缺損，減少腦梗死體積，MAP2表達水平明顯升高。對于銀杏葉提取物對腦保護的研究，Tang等研究認為銀杏提取物能部分恢復實驗鼠腦海馬回記憶和乙酰膽堿活性，但不能恢復生長激素釋放抑制激素水平，由此推論銀杏提取物通過影響膽堿能系統來保護大腦免受β－淀粉樣蛋白的損傷［10］。另外，銀杏提取物可通過抑制膠質纖維相關蛋白（GFAP）的生成及減少促凋亡基因bax的表達［11］，抑制血小板活化蛋白（PAF）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達［12］來減輕缺血再灌注損傷。本研究證實了銀杏提取物后處理在缺血再灌注24 h后的神經保護效果，但未對銀杏提取物后處理的神經保護作用進行長期觀察，這種保護作用是否持續存在以及保護機制的作用靶點如何等還有待深入研究。

總之，銀杏提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護效應，其效應可能與MAP2蛋白表達水平升高有關。

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6 王小姍，狄 晴，曹 輝，等.銀杏提取物對腦缺血再灌注鼠腦保護作用的研究.臨床神經病學雜志，2006，19（1）：53－55.

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