肺巨細胞癌細胞與支氣管上皮細胞分泌蛋白質的差異分析

李雪華，谷彥軍，劉 靜，劉燕青

(1武警后勤學院附屬醫院，天津300162;2天津市職業與環境危害防制重點實驗室)

肺癌的早期診斷至關重要，至今未找到能夠早期較好地發現肺癌的檢測方法［1，2］。近年來，蛋白質組學的研究為肺癌診斷標志物的發現提供了新的思路，故尋找肺癌相關蛋白質，進一步確立肺癌早期診斷標志物，是目前亟需解決的問題。2011年4月～2014年3月，我們觀察了肺巨細胞癌細胞株和支氣管上皮細胞株分泌蛋白質的差異，為進一步確定肺癌早期診斷相關蛋白標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳系統(proteanⅡxi cell)均購自Bio-Rad公司。固相pH梯度干膠條(pH 4～7，17 cm)、IEF buffer(pH 3～10)為 Bio-Rad公司產品;碘乙酰銨、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)等均為Sigma公司產品;1640培養基、胎牛血清為Gibco公司產品。圖像分析軟件為PDQuest8.0。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE用含10%胎牛血清的1640培養基于37℃、5%CO2條件下常規培養。待細胞長滿培養瓶，棄去培養基，PBS沖洗5次，加入無血清培養基再培養24 h，收集上清液，-80℃保存備用。

1.2.2 雙向電泳(2-DE)2-DE方法參照儀器操作手冊和文獻［3～5］進行。200 μg 蛋白質與上樣緩沖液充分混合，總體積為500 μL，上樣，固相pH梯度干膠條重水化16 h后等電聚焦電泳。電泳完畢，將膠條立即在平衡液A(6 mol/L尿素、2%十二烷基硫酸鈉、pH 8.8、0.05 mol/L Tris-HCL、20% 甘油、2%DTT)中平衡15 min，再于平衡液B(以2.5%碘乙酰胺替換平衡液A中2%DTT)中平衡15 min。平衡后進行垂直板SDS-PAGE電泳。然后將2-DE所得凝膠按文獻［6～8］進行硝酸銀染色。用透射掃描儀掃描染色后的2-DE凝膠。

1.2.3 凝膠圖像分析 用PDQuest8.0軟件分析掃描后的凝膠圖像。比較兩細胞株分泌蛋白質的2-DE圖譜，尋找差異蛋白質點。蛋白的相對表達量升高3倍或者降低2/3為差異點。

2 結果

2.1 分泌蛋白質2-DE圖譜建立 能夠獲得比較穩定的兩細胞株分泌蛋白質的2-DE圖譜，平均蛋白質點約200個。

2.2 分泌蛋白質2-DE圖譜差異分析 軟件分析顯示，兩細胞株共發現差異蛋白質點7個，肺巨細胞癌細胞株特有的差異點4個，量下調的差異點3個。

3 討論

目前，肺癌的診斷主要通過影像學檢查、纖維支氣管鏡及活體組織檢查，早期確診率不高，常常在確診時已達晚期，失去早期治療的機會。因此，尋找新的肺癌標志物是目前亟待解決的問題。

近年來，腫瘤蛋白質組學為肺癌的早期診斷研究提供了新思路。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，應用相關研究技術，從整體水平上來認識蛋白質的存在及活動方式［9～11］。2-DE和質譜是蛋白質組學研究的核心技術［12］。腫瘤蛋白質組學主要運用蛋白質組學相關技術發現腫瘤相關蛋白質，繼而研究其特性、結構和功能。

腫瘤在發生、發展過程中會分泌蛋白質進入血液。理論上，血清中肺癌細胞分泌的蛋白質的出現會早于X線上可見腫塊的形成。因此，肺癌細胞分泌的特異性蛋白質不但可以作為潛在的肺癌診斷標志物，而且對肺癌的早期篩選具有重要意義。

本研究比較了肺巨細胞癌細胞株95C和支氣管上皮細胞株16HBE分泌的蛋白質差異，尋找肺癌相關特異性蛋白質。在前期建立了穩定性、重復性較好的蛋白質2-DE技術基礎上［13］，利用2-DE分離分泌的蛋白質;建立了兩細胞株分泌蛋白質2-DE圖譜;通過PDQuest8.0軟件尋找差異蛋白質，發現肺巨細胞癌特有的差異蛋白質點4個，量下調的蛋白質點3個。肺癌特有的蛋白質是癌細胞分泌、釋放的，可能與腫瘤的發生、生長或轉移密切相關;而量下調的蛋白質有可能是一些抑癌基因作用的結果或者是一些對腫瘤生長或轉移起到調節作用的蛋白質。

總之，篩選出的這些差異蛋白質可能是肺癌發病或病程進展的重要相關蛋白質，對肺癌的早期篩選具有重要意義，有可能作為肺癌早期診斷的血清標志蛋白質。

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