單采血小板乙型肝炎病毒表面抗原快速檢測的漏檢分析

楊俊鴻，彭 楷，劉加偉，楊 培，駱展鵬，鄒曉萍，王娟娟（重慶市血液中心 400015）

我國是乙型肝炎的高流行區，約有10%人群為乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）攜帶者。為了最大限度保障獻血者的健康和降低經血傳播疾病的風險，以及減少血液報廢，血液采集前采用快速、高效的方法對獻血者進行篩查是十分必要的。由于采集單采血小板的耗材成本較全血高，以及獻血者血液中血小板達到單采血小板要求的獻血員相對較少，而臨床需求量大、輸入受血者體內的血液體積較多，因此單采血小板在采集前的篩查工作質量更顯重要。但在實際工作中前端篩查與血液最終檢測結果的符合性仍然存在一定的差距。為了分析并減小這種差距，作者針對HBsAg這個項目收集到了本中心2012年3月至2013年10月HBsAg前端膠體金法篩查陰性、采集后酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測呈反應性的31例單采血小板獻血員標本再次采用兩種方法檢測，分析快速檢測漏檢的原因。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2011～2013年本中心HBsAg實驗室ELISA檢測呈反應性的31例單采血小板獻血員血漿標本，標本收集后置于－30℃以下冷凍保存。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器 Xiril全自動加樣儀、BEPⅢ全自動酶聯免疫后處理系統、200mL移液器、秒表。

1．2．2 試劑 ELISA檢測HBsAg抗原診斷試劑盒、膠體金法HBsAg診斷試劑盒。

1．3 方法

1．3．1 標本準備 標本從冷凍冰箱取出后在37℃孵育箱內復融，并平衡40min，平衡后將標本充分混勻待測。

1．3．2 膠體金法 采用膠體金試紙條，按HBsAg診斷試劑盒（膠體金法）試劑說明書要求檢測標本，用移液器加樣80μL后開始計時，30min內觀察結果，只出現質控線為陰性結果，質控線和檢測線同時出現為陽性結果。記錄標本檢測結果以及陽性標本檢測線出現時間。

1．3．3 ELISA 按 HBsAg診斷試劑盒（ELISA）試劑說明書要求檢測標本，采用Xirl全自動加樣儀加樣，用BEPⅢ全自動ELISA后處理系統進行試驗及結果判讀，A值大于或等于CUT OFF值為陽性。設置室內質控，并且結果受控。

1．4 統計學方法 使用一般統計學方法計算前端漏檢標本中膠體金法檢測結果與ELISA結果總的一致性，ELISA陽性結果S／CO值小于10時結果的一致性、S／CO值在10～30時結果的一致性以及S／CO值大于30時的一致性。

2 結 果

2．1 31 例標本ELISA檢測結果均為陽性，再次用膠體金法檢測有16例陰性，15例陽性，總的一致性為48．4%。

2．2 ELISA陽性標本膠體金法檢測結果 S／CO值小于10前端篩查漏檢再次用膠體金法檢測為陽性結果的有3例，檢測線出現時間為8～12min，陰性14例，一致性為9．7%；S／CO值在10～30時用膠體金法檢測為陽性的標本總共有14例，檢測線出現時間為2～8min，陰性2例，一致性為45．2%；S／CO值大于30的9例標本再次用膠體金法檢測，在2～5min內全部檢出，一致性為100．0%。

3 討 論

膠體金法是20世紀90年代初在免疫滲濾技術基礎上建立起來的一種免疫學快速檢測技術，HBsAg膠體金試劑采用雙抗體夾心法，在硝酸纖維素膜上的檢測區包被抗－HBs，在對照區包被羊抗鼠IgG。檢測時，陽性標本中的HBsAg與試紙條前端的膠體金－抗體結合形成免疫復合物，在層析作用下，復合物沿膜帶移動，在檢測區形成紫紅色條帶。膠體金法檢測HBsAg因為其具有快速、操作簡單、準確率高、無需特殊設備等優點，被廣泛應用于血液采集前端篩查，但是由于方法的局限性，其檢測靈敏度較ELISA低。

膠體金法試劑靈敏度較ELISA低是引起漏檢的主要原因之一，膠體金法檢測靈敏度低于ELISA檢測靈敏度［1］。文獻［1］報道采用膠體金法檢測ELISA結果全陰性100例，HBsAg陽性、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）陽性和乙型肝炎病毒核心抗原（抗－HBc）陽性100例，HBsAg陽性、乙型肝炎病毒e抗體（抗－HBe）陽性、抗－HBc陽性100例和抗－HBs陽性100例，共400份新鮮血清。檢測這些血清中 HBsAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe以及抗－HBc，同時采用ELISA檢測相同的標本、相同的項目，ELISA嚴格按試劑盒說明書要求進行操作檢測。用ELISA檢測完成后，立即再用膠體金試劑進行檢測，將檢測試紙條的加樣區直接浸入待測血清中10s，取出后平放靜置，在5～30min內觀察檢測結果。膠體金免疫層析法和ELISA均采用原衛生部的乙型肝炎病毒質控樣品作為室內質控。以此評價膠體金法檢測血清乙肝免疫標志物的特異性和靈敏度。應用膠體金免疫層析法對各個濃度的質控樣品進行重復性測定，每個標本分別重復檢測20次。結果顯示1μg／L HBsAg和30U／L抗－HBs的20次結果均為陰性，其余各個濃度的質控樣品20次均為陽性。HBsAg項目與ELISA相比，膠體金法靈敏度為96．0%，特異性為100．0%，其靈敏度相對較低。更有資料報道S／CO值低于10時，膠體金法檢出率為0．0%［2］。文獻［2］報道采用2個廠家提供的HBsAg膠體金免疫層析法試紙條以及1個廠家提供的ELISA試劑共檢測600份血清標本的HBsAg，室內質控標本由康徹思坦公司提供，定值為2U／mL。方法嚴格按照3個試劑廠家的說明書規定以及試驗要求的環境條件下進行檢測。ELISA檢測時，每天用室內質控物進行質控，并確保在控。對檢測結果進行了統計分析，結果顯示2個廠家提供的膠體金法試劑檢測的陰、陽性結果與ELISA法檢測結果總的一致性分別為96．5%和97．3%，陽性標本檢測結果的一致性分別為86．7%和89．4%。陽性標本的S／CO值在10以下時，兩種國產試紙條的檢測結果與ELISA一致性均為0．0%，陰性標本的檢測結果的一致性均大于100．0%。表2數據表明S／CO值低于10的弱陽性標本總數為17例，膠體金法檢測陰性結果為14例，占弱陽性標本的82．4%，占總漏檢標本的45．2%；這是由于其檢測方法所決定的，對于此類漏檢不再繼續查找原因［3］。文獻［3］報道采用HBsAg膠體金試劑檢測 HBsAg定值血清1ng／mL（2U／mL）、2ng／mL（4U／mL）、5ng／mL（10U／mL），HBsAg標準物質4U／mL和陰性質控血清，檢測HBsAg強陽性血清6份、4U／mL陽性質控血清2份和陰性質控血清2份，同時記錄檢測對照線和檢測線出現的時間，同時采用ELISA檢測這些標本，結果S／CO值低于10的標本膠體金法未能檢出。但是作為一種病原體標志物的快速檢測試驗，應該是在確保特異性的前提下，選擇靈敏度較高的試劑。

檢測方法原因引起的單采血小板HBsAg快速檢測漏檢還包括試劑包被片段不同或者少數標本可能存在HBV變異或者亞型導致陽性標本漏檢［4］。如本次分析中有2例ELISA檢測S／CO值在10～20的陽性標本，再次用金標法檢測均為陰性結果，可能屬于此種情況。

檢測過程導致單采血小板HBsAg快速檢測漏檢的主要原因是工作人員操作不當所致。本次分析中5例S／CO值在10～20的陽性標本，再次用膠體金法檢測3例檢測結果為陽性，陽性結果檢測線出現時間在2～8min；同時有9例S／CO值大于30的強陽性標本，再次用檢測膠體金法檢測在5min內全部出現陽性結果。此類前端檢測漏檢再次用膠體金法檢測為陽性的標本總共有14例，占總漏檢標本的45．2%。檢測操作中如加樣量不足、稀釋液滴加時間或位置不正確、檢測試劑保存條件不符合說明書要求以及未及時將沒用完的試劑條密封保存等不規范的操作均可能導致高濃度的陽性HBsAg獻血員篩查時漏檢。與文獻［5］報道的膠體金法漏檢分析一致，該報道分析了2003年4～6月4 959份街頭獻血HBsAg膠體金法快速檢測的陰性標本，用兩種HBsAg－ELISA試劑嚴格按照說明書要求及步驟進行初復檢，兩種試劑檢測結果S／CO值均大于或等于1．0陽性者或其中一種試劑S／CO值大于或等于1．0，經同一試劑雙孔復查后任一孔結果S／CO大于或等于1．0為陽性。結果顯示有22例標本ELISA檢測HB－sAg結果為陽性，漏檢率為0．44%，將22份膠體金法漏檢標本再次用膠體金試劑檢測，有18例仍為陰性，4例為陽性。結果顯示的4例漏檢標本為人為原因引起，占18．18%。

檢測過程引起的另一個比較重要的漏檢原因為觀察時間不夠。本次分析中有3例弱陽性的標本檢測結果為陽性，但是陽性結果檢測線出現時間相對較長，在8～12min。在獻血員較多的情況下，前端快速檢測篩查判讀結果的時間有縮短的情況，也是造成部分弱陽性標本漏檢的原因。文獻［6］報道，觀察結果的時間延長至10～15min為宜。該文獻針對12 923份經膠體金法初篩合格的血液標本采用ELISA進行復檢，復檢陽性的標本再用膠體金法進行檢測，對其檢測結果進行分析。嚴格按照試劑說明書進行檢測。結果有213份標本ELISA結果為陽性，表明漏檢率為1．65%（213／12 923）；ELISA 結果S／CO值大于25．0的69份強陽性標本，膠體金法檢測5min內全部出現陽性結果；ELISA結果S／CO值為9．1～25．0的65份較強陽性血液標本，膠體金試紙條在5～10min內先后出現比較清晰的紫紅色條帶檢測線；ELISA結果S／CO值位于4．1～9．0的42份較弱陽性標本，10～15min內出現陽性結果，只是部分檢測線顯色過于淺淡；ELISA結果S／CO值介于1．0～4．0的37份弱陽性標本，超過15min后檢測線尚未顯色，按要求不再繼續觀察，按陰性結果處理。因此做采血前端快速檢測篩查的工作人員應摸索出最佳檢出效率與工作效率相匹配的判讀時間，以減少觀察時間不夠所引起的漏檢。

另外，文獻［7］報道，季節變化對膠體金法檢測結果也有影響，在溫度低、濕度高的季節，HBsAg膠體金法漏檢率較高。該報道將膠體金法對HBsAg檢測漏檢率與一年四季溫濕度的關系進行分析，統計了2008～2012年街頭采血車內溫度、濕度變化對膠體金法篩查HBsAg的影響，結果顯示，2008～2012年這5年間1～3月和10～12月這2個溫度低、濕度高的季節HBsAg平均漏檢率分別為0．73%和0．80%，高于其他2個季節（0．69%和0．68%）。由于無償獻血工作主要是在街頭采血車上進行，環境條件不易控制，在因此工作人員應該注意試劑使用的環境條件，盡可能在其適宜的溫度、濕度條件下進行檢測，降低漏檢率。

單采血小板前端篩查HBsAg是減少血小板報廢和預防輸血性感染乙型肝炎的一道重要防線，首先應選擇靈敏度和特異性都較好的試劑用于前端篩查，以減少試劑原因引起的漏檢。但是更重要的是要避免人為因素引起的漏檢，因此要加強快速檢測工作人員的素質培養，規范工作人員的操作步驟，保證檢測結果的真實性，減少經濟損失，減少寶貴的血小板資源浪費。

［1］ 陳瀑，康紅．膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎的評價［J］．臨床輸血與檢驗，2003，4（1）：30－31．

［2］ 張茂海，吳建業，陸玲娜，等．膠體金與酶聯免疫法檢測乙肝表面抗原結果分析［J］．國際檢驗醫學雜志，2011，32（14）：1625－1626．

［3］ 楊俊鴻，鄒曉萍，駱展鵬，等．快速檢測試劑質量控制研究［J］．國際檢驗醫學雜志，2013，34（12）：1578－1579．

［4］ 胡曉靜．金標法快速檢測HBsAg漏檢分析［J］．中國醫藥導報，2009，8（6）：69－79．

［5］ 李生菊．金標法快速檢測HBsAg漏檢原因分析［J］．青海醫藥雜志，2006，36（9）：51－52．

［6］ 符慧杰．膠體金法篩檢HBsAg漏檢原因與對策［J］．中國熱帶醫學，2004，4（3）：464－465．

［7］ 董韜，邱淑華，鄧振明，等．乙肝表面抗原金標法與酶聯免疫法吸附法的比較［J］．貴州醫藥，2013，10（37）：252－253．