Fas/FasL在輻射誘導膽管癌細胞凋亡發生和調控中的作用

趙曉丹 劉崢嶸 王紅巖

【摘 要】膽管癌發病率逐年升高，但研究進展緩慢，發病機理遠未明了，早期診斷困難，外科治療棘手，放化療均不敏感，預后差，是腫瘤臨床的一大難題。但隨著細胞凋亡的研究的進一步深入，給膽管癌的診治帶來了希望。Fas/FasL系統是凋亡發生和調控的重要因子。放療對腫瘤的作用主要是誘導其細胞凋亡。而在輻射誘導膽管癌細胞的凋亡中弄清Fas/FasL對其調控機制對膽管癌的發生發展，診斷治療及預后都有重要意義，本文結合有關文獻作一綜述。

【關鍵詞】膽管癌；輻射誘導；細胞凋亡 Fas/FasL

【文章編號】1004-7484（2014）04-2115-02

1 對細胞凋亡途徑的研究

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要的作用。目前對細胞凋亡途徑的研究已比較深入，總結查閱的文獻，目前已知的途徑有四種：

A死亡受體通路：又稱細胞外通路或細胞膜途徑。由死亡配體（如TNFα，FasL，TWEAK，TRAIL）與對應的死亡受體（TNFR，Fas，DR3，DR4/DR5）結合后啟動。此結合導致受體的三聚化，其胞內募集一些接頭蛋白（如TRADD、FADD）及胱冬肽酶（caspase-8）酶原形成一種信號復合物，復合物中的caspase-8酶原通過自身的蛋白酶水解作用形成活性形式，然后它將啟動caspase的級聯反應，使caspase-3、-6、-7激活，這幾種caspase可降解胞內結構蛋白和功能蛋白，最終導致細胞凋亡。此通路基本上不受bcl-2家族的影響。

B線粒體途徑：又稱細胞內通路。這條通路中細胞色素c的釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，釋放到細胞質的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其他的caspase（如caspase-3等），從而誘導細胞凋亡。細胞色素C從線粒體釋放的調節是細胞凋亡分子機制研究的關鍵問題。多數凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途徑。Bcl-2基因蛋白家族在這條通路中起了重要的作用。

C顆粒酶B直接活化效應Caspase途徑[1]。顆粒酶B（granzyme B）是CTL細胞的一個重要殺傷武器，它是已知唯一能夠激活Caspase的非Ca sp a se酶。在CTL細胞的細胞毒效應中，Caspase成員受顆粒酶B激活，通過酶解級聯反應，切割PARP，導致DNA片段化，終至細胞死亡。

D內質網途徑：細胞凋亡中鈣離子起了很重要的作用，在細胞凋亡過程中DNA的消化需要相關的Ca2+依賴性核酸內切酶的參與。內質網途徑主要受caspase12調控，也受Bcl-2家族蛋白質的調控。

2 輻射誘導細胞凋亡的信號轉導通路的研究

輻射可作用于細胞核和細胞膜，分別引起DNA損傷和神經酰胺的產生，DNA損傷和神經酰胺介導兩種不同的凋亡信號轉導通路[2]。

2.1 DNA損傷介導的凋亡信號轉導通路

輻射導致的DNA損傷后，有3種酶被激活：毛細管擴張失調癥突變激酶（ATM）、ATM相關激酶（ATR）和DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）。電離輻射時，主要是ATM使p53第15位上絲氨酸殘基磷酸化，破壞了p53-Mdm2的相互作用，取消了Mdm2對p53的抑制作用，導致p53穩定性和活性增強。p53激活以后又可通過線粒體和死亡受體兩種不同的途徑導致細胞凋亡[3]。

2.1.1.線粒體通路：p53上調Bax的表達，Bax轉移到線粒體外膜上，誘導線粒體釋放出促凋亡蛋白，如細胞色素C和凋亡誘導因子（AIF）等[4]，在ATP或dATP存在的情況下，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）相結合并促使Apaf-1形成寡聚體。由于Apaf-1與caspase-9前體之間具有同源結構域，通過蛋白質-蛋白質相互作用，Apaf-1募集胞漿中的caspase-9前體并以1∶1的比例與之結合，因此caspase-9前體也形成了聚合體。聚合的caspase-9前體通過自我活化產生了具有活性的caspase-9，caspase-9又活化caspase-3和caspase-7。活化caspase-3反過來又能激活caspase-9酶原，形成正反饋通路。caspase-3和caspase-7都是凋亡過程的主要水解酶，通過水解特異的蛋白底物而引起細胞凋亡[5]。活化的caspases反過來也可直接作用于線粒體外膜，引起外膜通透性增強，有利于細胞色素C釋放。

2.1.2.死亡受體通路：電離輻射可通過p53依賴的方式誘導死亡受體Fas及其配體Fas L（即CD95 L或CD178）的表達。p53增強Fas基因的轉錄，腫瘤細胞受到電離輻射后Fas L表達增強[6]FAS/FASL系統激活后通過死亡途徑介導凋亡。

2.2神經酰胺介導的凋亡信號轉導通路

輻射作用于細胞膜受體（如Fas受體和TNFα受體等），死亡受體聚合除了可以激活死亡受體凋亡通路以外，還可以激活酸性/中性鞘磷脂酶，產生神經酰胺[7]。另外，神經酰胺的產生途徑還有：①激活神經酰胺合成酶，從頭合成神經酰胺；②輻射直接裂解鞘磷脂產生神經酰胺[8]。神經酰胺是一種重要的第2信使，介導細胞的增殖、分化、生長抑制和凋亡等，其生物活性的多樣性與細胞類型有關[9]。神經酰胺主要通過激活MAPK信號通路和抑制Akt/PKB信號通路協同作用誘導細胞凋亡。

3 膽管癌細胞凋亡與Fas/FasL

3.1Fas/FasL研究現狀

3.1.1 Fas/FasL的結構與功能

Fas又稱Apo-1或CD95分子，屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族成員。Fas基因定位于人染色體10q23，其編碼產物為相對分子質量45×103的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區（157aa）、穿膜區（17aa）及胞漿區（145aa）組成。Fas的天然配體FasL（Fasligand），屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子超家族成員，在體內主要以膜結合形式存在，定位于人染色體1q23，其基因的編碼產物為相對分子質量40×103的Ⅱ型跨膜蛋白。Fas/FasL結合是激活體內Fas凋亡信號的惟一有效途徑。Fas/FasL介導的凋亡，在生物體內有重要的生理功能：①參與克隆選擇，使與自身抗原發生反應的T細胞凋亡；②介導細胞毒作用，殺傷靶細胞；③激活細胞誘導死亡（activation-inducedcell death，AICD）；④免疫赦免的形成，使眼、睪丸等器官免受免疫系統的攻擊；⑤參與免疫耐受的形成

3.1.2 Fas/FasL信號轉導通路 Fas-FasL結合觸發多個不同的路徑，并涉及半胱氨酸蛋白酶系列（caspases）錯綜復雜的相互作用。目前認為至少有4個信號轉導路徑，包括2個主要途徑和2個其它途徑。

3.1.2.1 主要途徑一：受CD95L刺激，CD95發生微聚化，通過同種蛋白相互作用，CD95誘導含死亡域（DD）的接頭蛋白FADD（Fas-associated death domain聚合，FADD利用其另一結構域DED募集含DED的caspase-8，c-FLIP，caspase-10，形成死亡誘導信號復合體（DISC），在DISC上出現大量活化的caspase-8，足以切割caspase-3，細胞呈現典型的凋亡形態學改變，此過程不需要線粒體參與。，Fas信號轉導又分成兩個不同的分枝路徑，這兩個途徑都依賴caspase-8的激活。一個分枝途徑直接引起其它caspases的一連串的水解活化。另一個分枝途徑稱脂質途徑，包括鞘磷脂水解和神經酰胺積聚。以上Fas/FasL信號轉導路徑的特點是需要足夠量的DISC，通過caspase-8的活化直接激活下游效應因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有這些Fas信號轉導特征的細胞稱為Ⅰ型細胞[11，12，13]

3.1.2.2主要途徑二：Fas-FasL相互作用后，細胞內沒有形成足夠量的DISC，caspase-8活化少，不足以切割caspase-3，它可能受凋亡抑制蛋白（IAP）保護，但此少量的caspase-8卻能切割胞漿中只含BH3結構域的Bcl-2家族成員Bid（Bcl-2 interacting domain）蛋白，產生的tBid移位到線粒體，誘導線粒體損傷，線粒體內促凋亡蛋白釋放，增強了凋亡信號，最終活化下游caspase-9，此過程必須依賴線粒體作用[10]。這一Fas/FasL信號轉導路徑的特點是caspase-9的激活發生在線粒體膜電位的變化之后，最后激活的caspase-9激活下游效應因子caspase-3，caspase-6和caspase-7。具有這些Fas信號轉導特征的細胞稱為Ⅱ型細胞[12，13，14]。

3.1.2.3 其它途徑一：Fas與FasL有效結合后，通過另一接頭分子-受體作用蛋白（RIP）（一種絲氨酸/蘇氨酸激酶）與RAIDD [RIP-associating IL-1βconverting-enzyme-like protease 1 （ICH-1）-homologous DD]和caspase-2（ICH-1）形成一復合物，轉導Fas信號，并且不依賴caspase-8的激活。

3.1.2.4 其它途徑二：此途徑是由另外一種Fas相關蛋白死亡結構域相關蛋白（DAXX）與凋亡信號調節激酶1（ASK1）形成復合物，熱休克蛋白Hsp27可抑制此復合物的形成[14～17]，然后此復合物激活c-JNK（c-Jun N-terminalkinase）和絲裂原，活化蛋白激酶p38，活化的p38激活caspases有關蛋白的基因轉錄。

3.2 FAS/FASL在膽管癌細胞的表達及意義

隨著分子生物學技術的發展，已初步了解膽管癌發生的相關因素與步驟。Fas/FasL系統的失調導致膽管癌細胞凋亡障礙并產生免疫逃逸，在膽管癌發生、發展及轉移中起著重要作用。有研究表明人肝門部膽管癌表達具有功能的FasL，因而膽管癌可通過FasL的表達來反擊人體免疫系統、獲得免疫赦免以助于其惡性生長。由此看來，“Fas-反擊”可能是人肝門部膽管癌免疫逃逸的一潛在的關鍵性的機制。而有些研究表明膽管癌同樣表達FAS，但卻沒有介導細胞凋亡，即出現所謂的FAS/FASL抵抗，究其原因可能有以下幾方面：1.Fas受體的因素即受體的質和量異常，膽管癌細胞不表達、低表達FAS抗原或表達無功能FAS[18-20]，亦或發生基因突變或呈可溶性分泌形式sFas，可以中和FASL間接抑制凋亡。2.FAS信號傳導途徑缺陷。表現為FADD等低表達或功能障礙、caspase-8點突變，caspase-1下調[21，22]，FLIPs阻斷FADD與pro-Caspase-8的作用，進而阻斷FAS受體的下游信號傳導。3.膽管癌細胞中還可能存在抑癌基因突變以及癌基因的協同作用[23]，如P53的突變導致FAS損傷，c-myc基因表達上調導致腫瘤通過FAS抵抗而得以惡化。4.膽管癌組織表達BCL-XL MCL-1 可阻斷FAS介導的凋亡。

3.3 FAS/FASL對誘導膽管癌細胞凋亡的調控

有研究[24，25，26]表明，射線照射可誘發鼠胸腺細胞及脾臟T、B細胞凋亡，并伴有Fas表達明顯升高。表明輻射導致或誘發了Fas介導的細胞凋亡。而在為數不多的研究文獻中，也發現輻射也可誘導膽管癌細胞凋亡，并也伴有FAS的表達升高。FAS/FASL系統可通過多種途徑介導凋亡，但在輻射誘導膽管癌細胞凋亡的過程中主要是通過哪種途徑介導的，目前沒有相關研究。FAS/FASL系統介導凋亡的過程中也受到多種抑制因子的調控。也就是說并不是所有表達FAS的膽管癌細胞系都對抗Fas抗體敏感。這些抑制因子包括SFAS、DcR3（decoy receptor 3，與Fas競爭結合FasL），FAP-1（fas-associated phosphatase-1具有與Fas細胞內結構域相互作用的能力，終止Fas誘導的凋亡），凋亡抑制劑蛋白IAPs

（inhibitors of apoptosis可與caspase-3，caspase-7，caspase-9的結合并抑制其活性），Bcl-2和Bcl-XL過表達可阻止線粒體釋放細胞色素C，從而保護Fas凋亡中的線粒體，等等。這也許可以解釋膽管癌對放療敏感差，但目前對于這些抑制因子在輻射誘導膽管癌凋亡過程中的表達水平沒有相關報道。由上可看出，Fas介導敏感性膽管癌細胞死亡必須具備至少三個條件：①細胞表面的Fas受體增加，②Fas與其廣泛交聯的特異性配體結合促進Fas受體帽的形成，③胞內凋亡拮抗蛋白（如Fap-1）的移除。

4 結語

膽管癌無論從早期診斷還是治療上都非常棘手，隨著細胞凋亡研究的不斷深入，為膽管癌的診治帶來了希望。通過各種化學藥物或局部輻射誘導膽管癌細胞凋亡已成為研究熱點。但其中許多機制尚不清楚。如輻射誘導膽管癌細胞凋亡中FAS/FASL如何參與凋亡調控目前還沒有太多研究。輻射誘導膽管癌細胞凋亡的過程中FAS/FASL主要是通過哪種途徑介導的，膽管癌細胞是屬于I型還是II型細胞，輻射是否可以激活膽管癌細胞膜表面其他受體途徑，如TNFR-2-NFκB軸的活化，該軸可抑制凋亡，促進細胞增殖，如有激活這兩者之間是如何相互調控的。Caspase眾多底物中哪些對誘導膽管癌細胞凋亡有調控作用等等。故弄清輻射誘導膽管癌細胞凋亡中Fas/Fasl的調控機制有助于發現腫瘤治療的新方法，為膽管癌的治療提供更多的出路。

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