饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態(tài)變化

杜良 鐘愛華 周兵飛等

摘要[目的] 為研究饑餓脅迫下魚類的生理生化變化提供參考。[方法] 采用傳統(tǒng)瑞氏染色法研究饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態(tài)變化。[結果] 大鱗副泥鰍的成熟紅細胞逐漸發(fā)生變化，先出現核膜溶解，然后出現細胞形變，接著出現核質擴散和細胞膜溶解，最后整個成熟紅細胞膜完全溶解，核染色反應由紫黑色變?yōu)樽霞t色最后變?yōu)榉奂t色。大鱗副泥鰍的幼稚紅細胞則明顯增多。[結論] 在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞出現核異常，主要表現為核膜溶解和核質擴散，因此紅細胞核異常可以作為饑餓脅迫的指標。

關鍵詞饑餓脅迫；大鱗副泥鰍；紅細胞；形態(tài)

中圖分類號S912文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07761-03

基金項目浙江海洋學院大學生科技創(chuàng)新項目（浙海院團〔2013〕38號）；浙江省教育廳科研項目（Y201328411）。

作者簡介杜良（1991-），男，山東濟寧人，本科生，專業(yè)：水產養(yǎng)殖。*通訊作者，講師，碩士，從事水生生物基礎生物學研究。

收稿日期20140707大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus），隸屬鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、花鰍亞科（Cobitinae）、副泥鰍屬（Paramisgurnus），我國除青藏高原外，各地區(qū)的河川、溝渠、水田、池塘都有大鱗副泥鰍的分布。大鱗副泥鰍肉質細嫩，味道鮮美，是一種高蛋白、低脂肪類的高檔營養(yǎng)珍品，被人們稱為“水中人參”；大鱗副泥鰍還具有較高的藥用價值，對肺炎、皮膚搔癢、跌打損傷、手指疔瘡、小便不暢和乳腺癌等均有一定的療效，因此泥鰍是一種生產潛力大、很有發(fā)展前途的養(yǎng)殖品種，國內外市場的需求量較大[1]。

饑餓是魚類在自然水域生態(tài)系中所必須面對的一種生理脅迫現象，產生饑餓脅迫的原因有自然界中食物分布在空間上的不均勻性、季節(jié)更替或環(huán)境劇變等，即使在養(yǎng)殖條件下由于養(yǎng)殖密度過大、個體間相互競爭、投餌不足、投喂技術不當等原因導致魚類出現因食物短缺而引起的饑餓脅迫[2]。饑餓脅迫既是魚類中經常面臨的生理脅迫現象，也是影響魚類正常生長、發(fā)育和生存的重要環(huán)境因子之一，對魚類正常生長、發(fā)育和生存產生重要影響。研究表明，饑餓可以影響魚類代謝、行為、組織結構、存活、繁殖、肌體組成成分、酶活性和恢復生長[3-5]。在自然環(huán)境下，因季節(jié)更替大鱗副泥鰍在冬季出現自然停食而處于饑餓狀態(tài)。目前，饑餓脅迫下大鱗副泥鰍紅細胞形態(tài)的變化尚未見報道。筆者研究大鱗副泥鰍饑餓脅迫下紅細胞的形態(tài)變化，以期為饑餓脅迫下魚類的生理生化變化提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗魚試驗用魚是由浙江省舟山臺島鰍業(yè)有限公司提供的同批次大鱗副泥鰍，共82尾。試驗開始前，將試驗魚放入特定的養(yǎng)殖箱內，養(yǎng)殖箱為400 L HDPE水箱，對試驗魚暫養(yǎng)7 d，以使其適應試驗環(huán)境。

1.2試驗設計及養(yǎng)殖管理在獲得試驗用魚后，將試驗魚平均分到3個平行養(yǎng)殖箱內（水體體積250 L），試驗魚體長（10±2）cm，初始體重為（15±3）g，每日中午12：00準時投喂由浙江省舟山臺島鰍業(yè)有限公司提供的顆粒飼料，至魚恰好飽食，進行為期10 d的適應性暫養(yǎng)，以消除其應激性。

適應性暫養(yǎng)期間，室溫控制在22 ℃；光照條件為弱光環(huán)境，在白天試驗室內關閉窗簾，晚上打開窗簾；養(yǎng)殖用水為學校自來水系統(tǒng)提供的自來水，經過48 h的曝氣后注入養(yǎng)殖箱內，每48 h換水1次，每次換水125 L；因大鱗副泥鰍所需氧氣量不像其他魚類那么多且其喜靜不喜動，因此不放置充氧設備，以免試驗魚受驚死亡，只通過換水的方式來提供其生存所需的氧氣。

經過適應性暫養(yǎng)后，便開始饑餓試驗。饑餓試驗期間，溫度、光照和氧氣等條件維持不變，僅停止投喂；每日觀察2次（早12：00和晚19：00），每周二上午10：00進行采樣。饑餓時間為42 d。

1.3樣本采集使用斷尾椎取血法采集樣本。樣本采集時，從3個平行養(yǎng)殖箱中各取2條體表完整、行為正常的大鱗副泥鰍，解剖后剪斷尾椎，取血。

1.4血涂片制作取2片準備好的載玻片，將斷尾處的血液擠出1滴，滴落在載玻片的左端；血滴半徑一般為2 mm；取推片置于玻片的近中心側，使推片和玻片間成45°～80°角，血膜兩邊留出一定的空隙；將推片向左移動，與血滴相接觸；當血液沿推片的邊緣分散后，以稍用力而平穩(wěn)的速度向右推。因為是全血涂片，第1次涂片時血膜較厚，因此進行第2次涂片，將推片上的殘血迅速擦干并在玻片上將血膜再次由左向右復推1次，此時血膜變得薄而均勻；將涂片置于試驗臺上自然風干。

1.5染色采用傳統(tǒng)的瑞氏染色法進行染色。使用瑞氏染色液（杭州天和微生物試劑有限公司出品）分別對8片血涂片進行染色，其中甲液（對氨基苯磺酸0.8 g溶解于100 ml 2.5 mol/L乙酸中）染色45 s，乙液（甲萘胺0.5 g溶解于100 L 2.5 mol/L乙酸溶液）染色7.5 min，然后流水沖洗并干燥。

1.6紅細胞形態(tài)觀察將染色后的涂片進行干燥并置于光鏡下觀察。隨機選取大鱗副泥鰍血涂片的視野，觀察紅細胞細胞質、細胞核的染色情況；記錄細胞膜、細胞質、細胞核及核膜的形態(tài)，將觀察到的結果進行備注并先使用Canon A3100彩色照相機進行拍照。同時，將染色效果好的涂片，置于奧林巴斯倒置顯微鏡下進行拍片。

2結果與分析

2.1成熟紅細胞的形態(tài)大鱗副泥鰍血涂片的有形成分中，紅細胞占絕大多數，紅細胞主要分為成熟紅細胞和幼稚紅細胞。大鱗副泥鰍成熟的紅細胞形態(tài)呈橢圓形或長橢圓形，表面光滑。細胞質不能被染色或出現極淡的藍色。核呈小橢圓形，核小而致密，位于細胞中央，染色反應為紫紅色或紫黑色。

大鱗副泥鰍成熟的紅細胞形態(tài)2.2幼稚紅細胞的形態(tài) 泥鰍幼稚紅細胞形態(tài)不規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，表面不光滑，部分有不規(guī)則突起。細胞質不能被染色或出現極淡的藍色。核圓形，位于細胞中央或稍偏向一側，染色反應為紫紅色或紫黑色（）。

大鱗副泥鰍幼稚紅細胞的形態(tài)2.3饑餓過程中紅細胞的形態(tài)變化饑餓至第7天，可觀察到大量成熟的紅細胞，細胞規(guī)則，界限清晰；還能觀察到少量的幼稚紅細胞，圓形，染色反應為紫黑色，直徑略小于成熟紅細胞的長徑。同時，觀察到少量的成熟紅細胞細胞核開始出現模糊現象，染色反應呈淡紫紅色。

饑餓第7天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)饑餓至第14天，依然可以觀察到大量的成熟紅細胞以及少量的幼稚紅細胞。但是，核膜溶解現象開始增多，部分紅細胞的細胞核開始擴散，溶解擴散的核染色反應為紫紅色（A），出現極少量完全溶解的細胞。同時，部分成熟紅細胞已經發(fā)生形變，不再維持橢圓形或長橢圓形，呈現雨滴狀或豌豆狀（B）。

注：A.核膜溶解；B.細胞形變。

饑餓第14天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)饑餓至第21天，依然能夠觀察到大量成熟紅細胞及少量幼稚紅細胞。但是，出現核膜溶解現象的成熟紅細胞開始大量出現，且部分成熟紅細胞核膜已經完全溶解，核質已經擴散，細胞體積增大，核呈現不規(guī)則形狀，染色反應為淺紫色或粉紅色。細胞形變進一步加劇，細胞膜溶解增加。

饑餓第21天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)饑餓至第28天，成熟紅細胞數量明顯減少，圓形幼稚紅細胞數量開始增多（A）。核膜完全溶解，核質擴散的成熟紅細胞急劇增多，細胞已不能維持正常形狀，并且能明顯觀測到完全溶解的成熟紅細胞的核質，染色反應為淺紫色或粉紅色（A）。另一方面，發(fā)生形變的細胞也急劇增多，多呈現雨滴狀，少數呈豌豆狀，且大部分發(fā)生形變的細胞細胞膜開始溶解（B）。

饑餓至第35天，成熟紅細胞已急劇減少，且大部分都已發(fā)生形變，與此同時幼稚紅細胞含量出現明顯上升。完全溶解的成熟紅細胞數量也明顯增加，染色反應為粉紅色。

饑餓至第42天，成熟的紅細胞含量進一步減少，只能觀測到少量未發(fā)生形變的細胞，同時能觀察到明顯增多的幼稚紅細胞。完全溶解的成熟紅細胞大量出現，染色反應為粉紅色。

通過觀察發(fā)現，大鱗副泥鰍成熟紅細胞含量隨著饑餓時間的延長而不斷下降，泥鰍的幼稚紅細胞相對數量明顯增多；形態(tài)上，泥鰍的成熟紅細胞形態(tài)變化表現為：先出現核膜溶解，然后出現細胞變形，接著出現核質擴散和細胞膜溶解，最后整個成熟紅細胞膜完全溶解，核染色反應由紫黑色變?yōu)樽霞t色最后變?yōu)榉奂t色。

注：A.細胞膜完全溶解和核擴散；B.細胞膜溶解。

饑餓第28天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)饑餓第35天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)饑餓第42天大鱗副泥鰍的紅細胞形態(tài)3 討論

在魚類中，除短腹冰魚等極少數南極目魚類沒有紅細胞或紅細胞含量很少外，絕大多數魚類的紅細胞含量均占其血細胞總量的90%以上[6]；該細胞呈橢圓形或長橄欖形，表面光滑，成熟紅細胞中央有1個圓形或橢圓形細胞核，與哺乳類的無核成熟紅血細胞顯著不同[6-7]。在大鱗副泥鰍外周血中能觀察到大量成熟紅細胞，正常生理狀態(tài)下其外形呈橢圓形，表面光滑，中央有1個圓形或橢圓形細胞核。然而，隨著饑餓時間的延長，其成熟紅細胞的形態(tài)發(fā)生了顯著變化，首先出現核膜溶解和細胞變形現象，然后核膜完全溶解核質擴散和細胞膜溶解，最后細胞膜完全溶解，僅剩下擴散的核質，稱為核影[7]，染色反應呈粉紅色。脾臟是魚類造血、過濾血液和破壞衰老紅細胞的中心場所。隨著饑餓時間的延長，大鱗副泥鰍外周血中出現大量的紅細胞核影，可能是因為饑餓不僅影響了紅細胞的形態(tài)，還影響了大鱗副泥鰍的脾臟功能，使其過濾血液和破壞衰老紅細胞的功能下降，導致大量被破壞的紅細胞無法自然清除。

魚類紅細胞與哺乳動物的紅細胞一樣，其主要機能為運輸O2和CO2，同時緩沖機體產生的酸堿物質以及維護體內離子平衡等。隨著饑餓時間的延長，大量成熟紅細胞遭到破壞，為了維持運輸氧氣和二氧化碳等生理功能，大鱗副泥鰍外周血中幼稚紅細胞的數量不斷增加。魚類造血器官除了脾臟外，還有腎臟等器官參與造血。在饑餓脅迫下，真正參與造血的器官還需進一步研究。

42卷23期杜 良等饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態(tài)變化由于某些因素造成紅細胞膜破裂和胞質外溢，而其核仍能在血液中存在一段時間，這種主要是核質的紅細胞被稱為“核影”紅細胞，由成熟紅細胞到“核影”紅細胞的過渡類型為分解紅細胞，“核影”紅細胞是紅細胞衰老過程中的形態(tài)表現，主要與魚體自身的生理狀態(tài)有關[8]。筆者發(fā)現在饑餓脅迫下隨著饑餓時間的延長，能觀察到成熟紅細胞、分解紅細胞和“核影”紅細胞。1982年，Hooftman[9]等首次證實化學誘變劑甲醛磺酸乙酯（EMS）能誘發(fā)泥蔭魚外周紅細胞微核形成及核異常。筆者也發(fā)現在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞出現核異常，主要表現為核膜溶解，核質擴散，因此紅細胞核異常可以作為饑餓脅迫的指標。

參考文獻

[1] 朱興國，葉永興，趙后會，等.泥鰍無公害高產高效養(yǎng)殖新技術[J].內陸水產，2007（1）：38.

[2] KIM M K，LOVELL R T.Effect of restricted feeding regimens on compensatory weight gain and tissue changes in channel catfish Ictalurus punctatus in ponds[J].Aquaculture，1995，135（4）： 285-293.

[3] LVAREZ A，GARCA B，GARRIDO M D，et al.The influence of starvation time prior to slaughter on the quality of commercial-sized gilthead seabream （Sparus aurata） during ice storage[J].Aquaculture，2008，284（1/4）：106-114.