宰后牦牛肉骨骼肌細(xì)胞凋亡過程研究

孫志昶等

摘 要：為研究宰后牦牛肉在成熟過程中前驅(qū)肱三頭肌（triceps brachi，TB）、中部背最長肌（musculus longissimus，ML）、后驅(qū)半膜肌（semimembranosus，SM）中骨骼肌細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，選取24頭甘南黑牦牛按照伊斯蘭屠宰方式進行屠宰，于0～4 ℃、風(fēng)速0.5 m/s條件下成熟，在宰后成熟過程中的不同時間點（1、3、5、7 d）進行細(xì)胞核的He染色觀察、原位末端法檢測骨骼肌細(xì)胞凋亡率以及caspase-3活力測定。宰后1 d，TB、ML和SM的骨骼肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，并且輪廓清晰，核質(zhì)均勻分布；隨著成熟時間的延長核染色質(zhì)凝聚在核膜下呈月牙狀，細(xì)胞核濃縮破裂形成凋亡小體，細(xì)胞體積皺縮變小。在宰后前3 d的ML和SM中幾乎檢測不到陽性細(xì)胞核；宰后5 d后TB和SM中陽性細(xì)胞核顯著增多（P<0.01）；宰后7 d，TB和ML中陽性細(xì)胞核數(shù)量差異極顯著

（P<0.01）；宰后12 h caspase-3 活力顯著高于宰后0.5 h的活力（TB，P<0.01；ML，P<0.001；SM，

P<0.01）；宰后12 h ML的caspase-3達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h 酶活力升高273.01%；TB和SM在宰后1 d達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h 酶活力分別升高了273.93%和386.17%；宰后5 d TB、ML和SM的caspase-3活力下降到最小值。結(jié)果表明：宰后成熟過程中牦牛肉的骨骼肌細(xì)胞核濃縮破裂形成凋亡小體和caspase-3活力的激活，同時陽性細(xì)胞核的檢出并且數(shù)量隨成熟時間增大，這一切都說明宰后牦牛肉骨骼肌細(xì)胞中發(fā)生了細(xì)胞凋亡，為宰后牦牛肉成熟機制提供一個更加合理、系統(tǒng)的解釋途徑。

關(guān)鍵詞：牦牛；成熟；細(xì)胞核；TUNEL；細(xì)胞凋亡

An Investigation of Skeletal Muscle Apoptosis during Postmortem Aging of Yak Meat

SUN Zhi-chang1 ， YU Qun-li1， HAN Lin1， ZHANG Wen-hua2， YANG Qin3

（1. College of Food Science and Engineering， Gansu Agriculture University， Lanzhou 730070， China； 2. Ningxia Xiahua Meat Food Co. Ltd.， Zhongwei 755000， China； 3. Gannan Institute of Animal Science and Veterinary， Hezuo 747000， China）

Abstract： The purpose of this study was to shed light on the occurrence of skeletal muscle apoptosis in triceps brachi （TB）， musculus longissimus （ML）， semimembranosus （SM） muscles from yak meat during postmortem aging. Totally 24 Ganan black yaks were selected and slaughtered in the Islamic way， and different muscles were excised from each carcass and aged under the conditions of 0–4 ℃ and 0.5 m/s for air flow rate. Morphological observation of the cell nucleus was performed using He staining at different time points during the aging process， and apoptotic index was measured by in situ end-labeling. Meanwhile， caspase-3 activity was assayed. At 1 d postmortem， the structure of the cell nucleus in the skeletal muscles TB， ML and SM was complete and apparent with evenly distributed nucleoplasm. As the aging progressed， the chromatin inside the nucleus was agglomerated to form a crescent-like shape， the cell nucleus was concentrated and broken， forming apoptotic bodies， and as a result， the cells were shrunk. Almost no positive cell nuclei were observed in ML and SM muscles within the first 3 d premortem. At 5 d postmortem， TB and SM muscles exhibited significantly increased counts of TUNEL-positive nuclei （P < 0.01）， and at 7 d， a significant difference in the count TUNEL-positive nuclei was noticed between TB and ML muscles （P < 0.01）. The caspase-3 activity was significantly higher at 12 h postmortem than at 0.5 h （TB， P < 0.01； ML， P < 0.001； SM， P < 0.01）. In ML muscle， this enzyme activity reached the maximum level at 12 h postmortem， showing a 273.01% increase over that observed at 0.5 h. In contrast， the enzyme activity reached the maximum level at 1 h postmortem， which was higher by 273.93% and 386.17% than at 0.5 h， respectively. At 5 h， the minimum levels of caspase-3 activity were detected in all the three muscles. In conclusion， during postmortem aging， the concentration and breaking of the cell nuclei in yak skeletal muscles to form apoptotic bodies， increased levels of caspase-3 activity， and the detectable presence of TUNEL-positive nuclei， positively dependent on aging time， together confirm the occurrence of skeletal muscle apoptosis， which offers a systematic and reasonable way to interpret the mechanism of postmortem aging of yak meat.

Key words： yak； postmortem aging； morphology； TUNEL； apoptosis

中圖分類號：TS251.52 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）05-0011-05

我國是世界上擁有牦牛數(shù)量最多的國家，世界95%以上的牦牛主要分布在以我國青藏高原為中心的高山草原上[1]。高海拔、遠(yuǎn)離污染、以天然牧草為食的生活環(huán)境，造就牦牛肉蛋白含量高、礦物質(zhì)豐富、脂肪少，是消費者青睞的天然綠色食品[2-3]。

宰后成熟過程中肉的各項品質(zhì)都會發(fā)生變化，隨著成熟時間的延長，嫩度和風(fēng)味會逐漸得到改善，肉的多汁性逐漸降低。Herrera-Mendez等[4]和Ouali等[5]發(fā)現(xiàn)宰后細(xì)胞骨架蛋白的降解是改善牛肉嫩度的主導(dǎo)因素。

Huang Ming等[6]認(rèn)為動物宰后成熟過程pH值的下降，加速了糖酵解，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生了變化，導(dǎo)致肌細(xì)胞變形，決定了肉的系水力和多汁性。由于動物宰后切斷了肌肉組織與外界環(huán)境的主要溝通，肌肉中骨骼肌細(xì)胞必然發(fā)生細(xì)胞凋亡[7]，成熟過程與凋亡過程類似，所以用細(xì)胞凋亡理論去解釋肉類宰后成熟機制是當(dāng)前研究的熱點。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺，由多基因協(xié)調(diào)控制的細(xì)胞自主的、有序的死亡方式[8]。在ATP存在的條件下，由于線粒體的通透性增加，細(xì)胞色素C和促調(diào)亡蛋白因子被釋放到胞槳中，連同其他蛋白激活半胱氨酸蛋白酶家族（caspase）下游效應(yīng)酶Caspase-3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜在凋亡小體形成前保持完整，染色質(zhì)凝聚在核膜下呈月牙狀，細(xì)胞核濃縮破裂形成凋亡小體，細(xì)胞體積皺縮變小[9]。Zhivotovsky等[10]等通過原位末端法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）分析觀察到豬骨骼肌肌細(xì)胞變性過程中DNA的降解，凋亡細(xì)胞核的數(shù)量占總細(xì)胞核的0.5%～2%。Altznauer等[11]研究表明，肌肉組織中caspase-3蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞凋亡量呈顯著相關(guān)性。

然而，在肉品科學(xué)領(lǐng)域，與細(xì)胞特征性凋亡方式有關(guān)的，宰后骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及生化研究非常缺乏。本實驗研究牦牛肉宰后成熟過程中不同部位肉骨骼肌細(xì)胞核形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡率和caspase-3活力的變化，從而確認(rèn)細(xì)胞凋亡過程是否發(fā)生在宰后成熟過程中的牦牛肉骨骼肌細(xì)胞中，對宰后牦牛肉成熟機制提供一個更加合理、系統(tǒng)的解釋途徑，為提高牦牛肉宰后成熟工藝和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛由甘肅康美集團提供。選取在專門的飼養(yǎng)場，由同一個飼養(yǎng)員飼養(yǎng)，自然放養(yǎng)、發(fā)育正常、健康無疾病、年齡在2～4 歲體質(zhì)量均勻的24 頭黑牦牛，宰前禁食16～18 h，只提供水。

蘇木素、伊紅、中性樹膠、餓酸、環(huán)氧樹脂、多聚甲醛、H2O2、甲醛、TritonX-100、檸檬酸鈉、NaCl、KCl、磷酸二鈉、磷酸二氫鉀 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TUNEL試劑盒 瑞士Roche公司；Ac-DEVD-AMC、CHAPS、HEPES、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-250型紫外分光光度計 日本島津公司；TGL-24MC型臺式高速冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；FA2004B型電子天平 上海佑科儀器有限公司；冰凍切

片機 德國萊卡公司；IX71顯微鏡 日本Olympus公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

選擇24 頭年齡體質(zhì)量相近的牦牛為實驗對象，對其進行隨機編號，集中屠宰，置于0～4 ℃、風(fēng)速0.5 m/s環(huán)境下成熟。取每組中的前驅(qū)肱三頭肌（triceps brachi，TB）、中部背最長肌（musculus longissimus，ML）、后驅(qū)半膜肌（semimembranosus，SM）3種不同部位肉樣，于成熟時間點上（1、3、5、7 d）進行細(xì)胞核的He染色觀察、細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)觀察、TUNEL檢測骨骼肌細(xì)胞凋亡率以及caspase-3活力測定。

1.3.1 牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞核的He染色觀察

取出液氮保持的組織樣，連續(xù)切片橫切10 μm的冷凍切片，固定于APES包被過的載玻片上，晾片5 min，蘇木素染液浸染3 min，70%和80%乙醇梯度脫水，然后用85%乙醇配制的酸化的伊紅溶液染色30s，80%、95%和100%梯度乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹膠封片。制備好的玻片在顯微鏡下進行觀察，細(xì)胞核的形態(tài)觀察需要在油鏡下進行拍照。

1.3.2 原位末端法（TUNEL）檢測骨骼肌細(xì)胞凋亡率

在冷凍切片機上將組織塊連續(xù)切片，10 μm的橫切片固定于載玻片上，室溫下晾片5 min，于4%多聚甲醛溶液中固定，然后用含3% H2O2的甲醛溶液封閉，浸入含0.1% Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉溶液中通透。將通透好的切片用1×PBS（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L

KCl、4.3 mmol/L磷酸二鈉、1.4 mmol /L磷酸二氫鉀、pH7.4）漂洗，瀝干，用羊清封閉30 min，漂洗用1×PBS洗30 min，按照體積比1∶9加入末端標(biāo)記酶和標(biāo)記液配制成TUNEL 反應(yīng)工作液，將反應(yīng)工作液滴加覆蓋切片，然后將切片放置于濕盒中，37 ℃避光孵育60 min，陰性對照組不加末端標(biāo)記酶，采用標(biāo)記液替代反應(yīng)工作液，陽性對照組在添加TUNEL反應(yīng)混合物之前先用5.1 U/mL的DNase I室溫下孵育10 min。將處理好的組織用甘油封片，熒光顯微鏡觀察和計數(shù)。每個樣本在200 倍鏡下至少計算3 個不同的視野，最終的凋亡量用平均每個正常細(xì)胞所含陽性凋亡細(xì)胞核數(shù)目來表示。

1.3.3 Caspase-3活力測定

取冷凍樣品200 mg，在冷凍條件下0.5 mL，100 mol/L

mhepes（pH7.5、10%蔗糖、0.1% NP-40、10mol/L

m DTT）的裂解液中破碎，勻漿，反復(fù)凍融3次

（―20℃），18 000×g離心30 min，取上清液，置于4 ℃條件下備用。由20 μL裂解物上清液、 0.2 mL反應(yīng)緩沖液（10% sucrose、0.1% CHAPS、100 mmol/L HEPES、pH7.5）和5 μL重建的熒光底物構(gòu)成反應(yīng)液。caspase-3的底物分別是Ac-DEVD-AMC。將反應(yīng)液置于96孔板的酶標(biāo)儀中在37 ℃條件下孵化1 h，然后分別于360 nm和460 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下讀取熒光強度。酶活力單位用每分鐘、每毫克肉樣的相對熒光強度表示。

1.4 統(tǒng)計分析

用SASS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，用Origin 8作圖軟件進行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞核形態(tài)變化分析

a. TB 1d；b. TB 3d；c. TB 5d；d. TB 7d；e. ML 1d；f. ML 3d；

g. ML 5d；h. ML 7d；i. SM 1d；j. SM 3d；k. SM 5d；l. SM 7d。

圖 1 牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞核形態(tài)變化

Fig.1 Morohological changes of yak muscles during postmortem aging

如圖1所示，宰后1 d TB、ML和SM 的骨骼肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，并且輪廓清晰，核質(zhì)均勻分布。但是隨著牦牛肉宰后成熟時間的延長，細(xì)胞間隙逐漸增大；如圖中箭頭所示，在宰后3、5、7 d中TB、ML和SM的部分細(xì)胞核核質(zhì)開始向邊緣遷移，形成類似半月形的嗜蘇木素的凋亡小體，同時細(xì)胞核皺縮的增加，這種特征是典型的細(xì)胞凋亡[12]；在這期間TB、ML和SM中部分細(xì)胞核的核質(zhì)濃縮損失，形成沒有核質(zhì)的細(xì)胞核，這些特征表示細(xì)胞壞死。從圖1中骨骼肌細(xì)胞的總體形態(tài)變化過程來看，牦牛宰后TB、ML和SM的骨骼肌細(xì)胞中同時發(fā)生了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。

從宰后骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化中發(fā)現(xiàn)，隨著牦牛肉宰后成熟時間的延長，細(xì)胞間隙逐漸增大，Pinton[13]發(fā)現(xiàn)化學(xué)試劑有限公司骨骼肌細(xì)胞之間的間隙是由水分分布引起的，肌肉胞漿的酸化（pH值降低）會導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷的下降及疏水性的提高，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增大。Harwood等[14]研究發(fā)現(xiàn)，宰后4 d牛肉中pH值下降到最小值，隨后呈上升趨勢，但是本實驗中宰后5 d到7 d細(xì)胞間隙繼續(xù)增大，Becila等[15]認(rèn)為pH值沒有下降時細(xì)胞間隙的增大是因為細(xì)胞發(fā)生凋亡、產(chǎn)生皺縮而引起的。Porn-Ares等[16]觀察到細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞只是分離，細(xì)胞本身沒有發(fā)生分裂，與本實驗結(jié)果類似，說明宰后成熟過程牦牛骨骼肌細(xì)胞中發(fā)生了細(xì)胞凋亡。

2.2 牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞凋亡數(shù)量分析

細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，由于骨骼肌細(xì)胞中DNA的降解和出現(xiàn)碎片化，從而產(chǎn)生大量的黏性3-OH末端，可用熒光標(biāo)記的末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)dUTP（fluorescein-dUTP）TUNEL法進行凋亡細(xì)胞核的檢測[17]，被認(rèn)為是定性檢測細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法，具有靈敏性高、針對性強和可量化凋亡程度的特點。如圖2所示，采用TUNEL染色法對宰后不同部位牦牛肉骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率進行了檢測，發(fā)現(xiàn)TB的凋亡細(xì)胞核的數(shù)量從宰后1d到宰后5d呈緩慢的線性增多，宰后5 d后迅速增多。在宰后前3 d 的ML和SM中幾乎檢測不到陽性細(xì)胞核，從宰后3 d 開始ML和SM中的陽性細(xì)胞核呈顯著增加

（P<0.05），宰后5 d 后TB和SM中陽性細(xì)胞核顯著增多（P<0.01）。宰后7 d，TB和ML中陽性細(xì)胞核數(shù)量差異極顯著（P<0.01）。

圖 2 牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞凋亡率分析

Fig.2 The rate of apoptosis in yak muscles during postmortem aging

宰后5 d后TB和SM中陽性細(xì)胞核顯著增多

（P<0.01），這與Ouali等[5]的研究結(jié)果相反，他們認(rèn)為細(xì)胞凋亡可能發(fā)生在尸僵前，這可能是因為檢測方法不同所造成的。宰后7d，TB和ML中陽性細(xì)胞核數(shù)量差異極顯著（P<0.01 ），TB中的凋亡細(xì)胞核數(shù)量最多，其次是SM，最后是ML，這說明陽性細(xì)胞核數(shù)量的多少與特定的肌纖維組成有關(guān)。Gupta等[18]認(rèn)為肌纖維是組成肌肉的基本單位，不同部位分割肉的纖維類型組成比例存在差異。Kemp等[19]在豬骨骼肌的檢測中報道，不同部位肌肉中氧化型肌纖維（I 型）的比例差異顯著。Brunelle等[20]研究證明肌纖維類型反應(yīng)的是肌肉代謝特性，氧化型肌纖維（I 型）的比例不同，導(dǎo)致糖酵解和有氧代謝率不同，而Degterev等[21]發(fā)現(xiàn)肌肉中高比例的氧化型肌纖維（I 型）構(gòu)成的肌肉線粒體對細(xì)胞凋亡更加敏感，說明肌肉組織中氧化型肌纖維（I 型）的比例與細(xì)胞凋亡存在某種聯(lián)系。

2.3 牦牛肉宰后Caspase-3活力變化

圖 3 牦牛肉宰后Caspase-3活力變化

Fig3 Caspases-3 activity changes of yak muscles during postmortem aging

Caspase-3為細(xì)胞調(diào)亡的重要執(zhí)行分子，在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用[22]。因此檢測Caspase-3是否被激活也是判斷細(xì)胞凋亡的一個重要手段。如圖所示，宰后0.5h，TB、ML和SM中caspase-3無顯著差異

（P>0.05），宰后12h caspase-3活力顯著高于宰后0.5 h的活力（TB，P<0.01；ML，P<0.001；SM，

P<0.01）。宰后12 h ML的caspase-3達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h酶活力升高273.01%；TB和SM在宰后1 d達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h 酶活力分別升高了273.93%和386.17%。之后，TB、ML和SM的caspase-3活力出現(xiàn)顯著下降趨勢，宰后3 d ML 的caspase-3活力趨于平穩(wěn)，差異不顯著（P>0.05）。宰后5 d TB、ML和SM的caspase-3活力下降到最小值。

Underwood等[23]研究顯示，牛肉宰后caspase-3酶活力無顯著變化，與本研究結(jié)果相反。Kemp等[19]在宰后1h豬背最長肌中檢測到caspase-3的酶原片段，宰后8h豬背最長肌中caspase-3活力達(dá)到最高值，與本研究結(jié)果相似，說明caspase-3參與了牦牛肉宰后成熟過程。Arur等[24]研究表明細(xì)胞色素C能與Apaf-1（調(diào)亡酶激活因子-1）、caspase-9前體和ATP/dATP形成Apoptosome（調(diào)亡小體），激活調(diào)亡caspase-3，從而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，本實驗中從宰后0.5 h檢測到caspase-3活力，宰后12 h ML的caspase-3達(dá)到最高活力，由此判斷出牦牛肉宰后骨骼肌細(xì)胞中發(fā)生了細(xì)胞凋亡。

3 結(jié) 論

宰后1d，TB、ML和SM的骨骼肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，并且輪廓清晰，核質(zhì)均勻分布；隨著成熟時間的延長核染色質(zhì)凝聚在核膜下呈月牙狀，細(xì)胞核濃縮破裂形成凋亡小體，細(xì)胞體積皺縮變小，這是細(xì)胞凋亡的典型征。

宰后前3 d的ML和SM中幾乎檢測不到陽性細(xì)胞核；宰后5 d 后TB和SM中陽性細(xì)胞核顯著增多（P<0.01）；宰后7 d，TB和ML中陽性細(xì)胞核數(shù)量差異極顯著

（P<0.01）。

宰后12h caspase-3活力顯著高于宰后0.5h的活力（TB，P<0.01；ML，P<0.001；SM，P<0.01）；宰后12 h ML的caspase-3達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h酶活力升高273.01%；TB和SM在宰后1 d達(dá)到最高活力，較宰后0.5 h酶活力分別升高了273.93%和386.17%；宰后5 d TB、ML和SM的caspase-3活力下降到最小值。

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