千層金精油有機溶劑提取工藝的優化及成分分析

葉征美 劉鑫 沈明娟等

摘 要 采用有機溶劑萃取法提取千層金精油，在單因素試驗的基礎上，以石油醚（60～90 ℃）為提取溶劑，選取提取時間、提取溫度、料液比為影響因素，用正交試驗優化千層金精油的提取工藝，并采用氣相色譜-質譜（GC-MS）技術鑒定了千層金精油的化學成分。結果表明，千層金精油的最佳提取工藝條件為：提取時間3 h，提取溫度50 ℃，料液比1 ∶ 20，在此工藝條件下的精油提取得率4.51%。GC-MS分析結果表明，千層金精油共含有41個組分，主要成分為甲基丁香酚，相對含量達到了83.55%，其次為肉桂酸甲酯（4.55%）、3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯（1.81%）、大根香葉烯D（1.36%）。

關鍵詞 千層金；精油；有機溶劑提??；正交試驗；氣相色譜-質譜

中圖分類號 TQ65 文獻標識碼 A

千層金（Melaleuca bracteata），又名黃金寶樹、黃金香柳，屬于桃金娘科白千層屬，為常綠喬木。原產于新西蘭、澳大利亞，是從白千層屬植物中選育出來的變異新種，于1999年引進我國[1]，目前主要應用于園林觀賞樹木種植。千層金是優良的彩葉樹種，樹形優美，具備較高的觀賞價值，耐水淹、抗鹽堿，特別適合沿海地區城市綠化使用，是目前世界上最流行、視覺效果最好的色葉喬木新樹種之一，可用于庭園景觀、道路美化、社區綠化，也可用于林相改造；千層金葉芳香宜人，揮發性精油含量高，其所含的芳香油是目前世界上珍貴的化妝品香料之一，而且千層金精油具有很強的殺螨活性[2]和驅蟲性[3]，值得進一步的推廣種植和開發應用。鐘昌勇等[4]的試驗結果表明，采用水蒸餾法提取千層金枝葉精油，其得率可達到1.13%，精油的主要成分為甲基丁香酚，含量超過95%。目前，關于千層金精油提取工藝的研究仍很少，精油的組成成分及含量也有待于進一步研究。

植物精油傳統的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、壓榨法、吸收法等，隨著科學進步與技術的發展，一些新型的精油提取方法也相繼出現，如超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取法、分子蒸餾法、微膠囊-雙水相萃取法等。有機溶劑萃取法是用揮發性有機溶劑如石油醚、乙醚等連續回流提取或浸提，將植物原料中的某些成分浸提出來，后提取液經蒸餾或減壓蒸餾去除溶劑，即可獲得粗制精油[5]。有機溶劑萃取法具有所需設備簡單、產品得率高、萃取范圍寬等優點，被廣泛應用于植物精油的提取，如廖玉琴[6]等采用有機溶劑浸提法通過正交試驗對檸檬精油的提取工藝進行優化，張艷[7]等研究了不同溶劑提取桂皮精油的最佳條件及成分的差異性。隨著科學技術的發展，有機溶劑萃取法也不斷得到改善，并延伸出了多種更為高效、便捷的精油提取方法，如超聲波輔助萃取法[8]、微波輔助萃取法[9]等。

本研究采用有機溶劑萃取法，通過設計正交試驗優化了千層金精油的提取工藝，研究不同工藝參數（有機溶劑、萃取時間、萃取溫度、料液比）對千層金精油的影響規律，確定千層金精油有機溶劑提取的最佳工藝條件；并采用氣相色譜-質譜（GC-MS）技術分析和鑒定千層金精油的化學成分，旨在為千層金精油的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 材料：千層金葉片（采自福建農林大學植物園）。

試劑：石油醚（沸程60～90 ℃）、正己烷、乙醚、甲醇、乙酸乙酯均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。二氯甲烷為色譜純，購自德國Merck公司。

1.1.2 主要儀器 LGJ-25C型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司），FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），EL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），ZHWY-2008型全溫度恒溫培養震蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），N-1001型旋轉蒸發儀（日本EYELA公司），6890N-5973I型氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司），DB-5MS型色譜柱（美國Agilent公司），毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 摘取無機械損傷、無病蟲害的千層金葉片，在凍干機內凍干48 h后取出，用粉碎機磨成粉末，過40目篩。后置于-20 ℃冰箱內備用。

1.2.2 提取方法 取樣品5 g，裝于帶蓋子的玻璃瓶中，置于轉速為120 r/min的恒溫培養震蕩器內，設置一定的溫度、料液比和時間等參數進行有機溶劑萃取，萃取液經抽濾后取出，濾渣再重復萃取1次，合并濾液；濾液經旋轉蒸發除去有機溶劑，得精油，稱取質量，計算精油得率，每組實驗重復3次。

提取率/%=所得精油質量/提取前物料質量×100

1.2.3 單因素試驗

（1）萃取溶劑。選取石油醚、正己烷、乙醚、甲醇、乙酸乙酯等5種有機溶劑在40 ℃、料液比1 ∶ 20條件下萃取4 h，研究這幾種有機溶劑對千層金精油提取的影響。

（2）萃取時間。以石油醚作為提取溶劑，在提取溫度40 ℃、料液比1 ∶ 20條件下研究不同浸提時間水平（1、2、3、4、5 h）對千層金精油提取率影響。

（3）萃取溫度。以石油醚作為提取溶劑，在提取時間3 h、料液比1 ∶ 20條件下研究不同溫度（30、40、45、50、55、60 ℃）對千層金精油提取率的影響。

（4）料液比。以石油醚作為提取溶劑，在提取時間3 h、提取溫度為50 ℃條件下研究不同料液比水平（1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35）對千層金精油精油提取率影響。

1.2.4 正交試驗 根據單因素實驗結果，選取萃取時間（A）、萃取溫度（B）、料液比（C）三因素，進行 L9（33）正交試驗。

1.2.5 有機溶劑提取千層金精油成分分析 取樣品5 g，在溫度為50 ℃、料液比為1 ∶ 20、時間為3 h的條件下進行有機溶劑萃取，萃取液經過濾后取出，濾渣再重復萃取1次，合并濾液；濾液經旋轉蒸發除去有機溶劑，得精油。精油經無水二氯甲烷溶解稀釋后供GC-MS分析用。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS；毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速 1.0 mL/min；升溫程序為：柱初溫 50 ℃，保持5 min，以3 ℃ /min 升溫至100 ℃，保持 5min；再以 5 ℃/min 升溫至 250 ℃ ，保持 2 min。分流比為5 ∶ 1。

質譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描質量范圍m/z 45～550。

1.3 數據處理與分析

1.3.1 正交實驗數據統計方法 采用DPS 數據處理系統對正交試驗結果進行分析，并應用Originpro 7.5軟件作圖。

1.3.2 千層金精油成分鑒定方法 采用GC-MS分析鑒定，所得色譜和質譜信息經計算機數據處理系統對NIST05標準譜圖庫進行檢索和人工檢索，同時結合其保留時間，進行對照和解析，確認各化合物，并用峰面積歸一化法確定各成分的質量分數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 不同有機溶劑對千層金精油提取的影響

采用不同有機溶劑萃取千層金浸提物的提取率如圖1所示，千層金在不同溶劑中精油浸提的結果見表1。試驗結果表明，以無水乙醚和乙酸乙酯作為溶劑的提取率都高于30%，但是提取出的精油呈青綠色且氣味差，可能是由于浸提過程中，千層金葉片中的葉綠素等其他物質一同被提取出來，導致精油不純；甲醇溶劑也會浸提出一部分的葉綠素等雜質，氣味不佳；石油醚和正己烷提取精油的得率雖然不高，分別為3.78%和2.96%，但是雜質很少，氣味芳香、濃郁，石油醚在相同提取條件下精油得率稍高于正己烷，綜合考慮后選用石油醚作為千層金精油有機溶劑浸提的最佳溶劑進行以下單因素和正交試驗。

2.1.2 浸提時間對千層金精油提取的影響 從圖2可見，隨著萃取時間的延長，提油量逐漸上升，當萃取時間達到3 h后，延長萃取時間提油量變化不大，這是由于在提取的初始階段，物料中的精油含量較高，固液間存在較大的濃度差，擴散驅動力較大，油脂分子不斷擴散到溶劑中，提油率不斷升高；但隨著提取時間延長，溶劑中油脂量趨于飽和，溶液體系滲透壓趨于平衡，提油率不再增加，因此浸提時間選3 h比較適宜。

2.1.3 萃取溫度對千層金精油提取的影響 由圖3表明，隨著溫度上升，精油提取量隨之增加，溫度達到50 ℃后，精油提取率達4.49%，但當溫度升高到55 ℃時，提油量下降，這可能是溫度的升高增強了分子之間的擴散作用，促進了溶劑分子滲透到物料的細胞內部，溶質分子擴散到溶劑中，從而提高了提取率，但是隨著提取溫度進一步的升高，溫度接近石油醚沸點，石油醚損失，導致提油率下降。當萃取溫度達到60 ℃時，精油提率大幅升高，但是精油的味道有略微灼燒味，可能是由于溫度太高，瓶內樣品處于蒸煮狀態，將部分雜質也提取出來，所以得率驟然上升。因此，提取溫度選50 ℃比較適宜。

2.1.4 料液比對千層金精油提取的影響 圖4表明，提取精油量隨著料液比的減小而增大，在料液比為1 ∶ 20提取精油量達到最大值，隨后提取精油量呈下降趨勢，這是因為隨著料液比的減小，增加了物料與溶劑的接觸面積，并且增大了固液濃度差，提高了油脂分子的傳質速率和擴散速度，從而增加了精油的提取得率[10]。但過多的溶液反而使精油得率減小，不僅造成溶劑的浪費，后期濃縮成本也高。因此，料液比選1 ∶ 20比較適宜。

2.2 正交試驗結果分析

由于萃取時間、萃取溫度、料液比3個因素間能相互影響，因此在上述3個單因素試驗的基礎上，采用 L9（33）正交表安排試驗，以提取精油量作為試驗指標，通過正交實驗優化得到石油醚提取千層金精油的最佳工藝。因素-水平安排表見表2，正交試驗結果如表3所示。

由表3直觀分析可知：極差RA>RC>RB，由此可知，各因素對有機溶劑提取法提取千層金精油的影響程度依次為：A（時間）>C（料液比）>B（溫度）。即提取時間是千層金精油有機溶劑浸提工藝的最關鍵控制因素，其次為料液比和提取溫度。從k值大小可知，最優化工藝組合條件為A2B2C2，即：提取時間3 h，提取溫度為50 ℃，料液比l ∶ 20。但該條件不在以上9組試驗中，對該條件進行3次驗證試驗，其出油率的平均值為4.51%，說明A2B2C2為最優組合。

2.3 有機溶劑萃取法提取千層金精油的成分分析

有機溶劑萃取千層金精油的GC-MS總離子流圖見圖5，千層金揮發物質的化學組成見表4。在本試驗千層金精油總共檢測出41種物質，含量占峰面總面積的96.72%，甲基丁香酚是千層金精油含量最高的一種物質，其相對含量達到83.55%，其次為肉桂酸甲酯（4.55%）、3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯（1.81%），大根香葉烯D相對含量為（1.36%），其他檢測出的成分相對含量均未達到1%以上。通過成分歸類分析表明，千層金精油成分主要是醚類物質，共3種，占總面積的83.97%，其次為酯類5種，占6.69%，烯烴類化合物共18種，占3.59%，烷烴類化合物共10種，占1.85%。此外還有少量的酚類化合、芳香烴類化合物、醇類化合物等。

3 討論與結論

3.1 討論

本研究采用正交試驗方法優化了千層金精油的有機溶劑萃取工藝，在提取溫度50 ℃、料液比1 ∶ 20下提取3 h，精油得率可達到4.51%，比鐘昌勇等[4]采用水蒸汽常壓回流蒸餾法提取千層金精油得率（1.13%）高，而且有機溶劑萃取獲得的精油呈現淡黃色，氣味芳香、濃郁，油品高。

本研究對千層金精油總共檢測出41種物質，其中甲基丁香酚含量最高，相對含量達到83.55%，這與前人的報道相吻合。鐘昌勇[4]等的試驗結果表明，千層金枝葉的水蒸汽萃取精油共鑒定出42種成分，甲基丁香酚的相對含量達到95.45%；Aboutabl[11]等也有相似報道，埃及產千層金葉片的水蒸汽蒸餾物中甲基丁香酚的相對含量高達97.7%。本研究采用有機溶劑萃取千層金精油，可有效提取出除甲基丁香酚外的其它精油組分，如肉桂酸甲酯（4.55%）、3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯（1.81%）、大根香葉烯D（1.36%）等。然而，也有文獻[2]報道泰國品種千層金精油的主要成分為甲基異丁香酚（28.98%）、 欖香素（21.57%）、2，3-Dimethoxy-5-propen-2-yl-phenol（20.26%）、甲基丁香酚（14.61%），這可能與千層金的品種、產地以及試驗設計等有關。

甲基丁香酚在許多植物精油中都存在，如細辛、肉豆蔻、辣椒、檸檬草、龍蒿、羅勒、八角茴香和茴香等。有報道顯示，甲基丁香酚具有很強的誘殺桔小實蠅的能力，被作為果蠅誘劑應用[12-14]，在植物保護上具有潛在的利用價值；甲基丁香酚對多種食源性真菌、細菌和酵母菌具有很強的抗菌活性[15]，這可能和甲基丁香酚作為潛在的群體感應抑制劑有關[16]。甲基丁香酚還具有較強的中樞抑制作用，其鎮靜、鎮痛、麻醉、降溫等作用尤為明顯。此外，甲基丁香酚由于能直接松弛氣管平滑肌，因此有鎮咳作用。本研究提取的千層金精油中富含甲基丁香酚，而且本研究從千層金葉片中提取到的肉桂酸甲酯已被廣泛應用于香料和防曬護膚品中[17]，3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯等物質是抗焦慮藥曲美托嗪、腸胃藥馬來酸曲美布汀等的主要原料，大根香葉烯 D是許多倍半萜烯碳氫化合物的前體[18]，這些都顯示了千層金具有潛在巨大的研究前景和應用價值，值得進一步深入研究。

3.2 結論

（1）采用有機溶劑萃取法提取千層金精油，以石油醚（60～90 ℃）為提取溶劑，選取提取時間、提取溫度、料液比為影響因素，獲得的千層金精油的最佳提取工藝條件為：提取時間3 h，提取溫度50 ℃，料液比1 ∶ 20，在此工藝條件下的精油提取得率為4.51%。

（2）采用氣相色譜-質譜（GC-MS）技術鑒定了千層金精油的化學成分，結果表明，采用有機溶劑萃取法提取獲得的千層金精油共含有41個組分，主要成分為甲基丁香酚，相對含量達到了83.55%，其次為肉桂酸甲酯（4.55%）、3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯（1.81%）、大根香葉烯D（1.36%）。

參考文獻

[1] 龔 崢， 周麗華， 張衛華， 等. 黃金香柳組織培養與快速繁殖[J]. 廣東林業科技， 2009， 25（5）： 50-53.

[2] Mitsuyoshi Yatagai， Tatsuro Ohira， Kiyoshi Nakashima. Composition， miticidal activity and growth regulation effect on radish seeds of extracts from Melaleuca species[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 1998， 26（7）： 713-722.

[3] Jacobson， M. Chemical insects attractants and repellents[J]. Annual Review of Entomology， 1966， 11： 403-422.

[4] 鐘昌勇， 黃祖強， 梁忠云， 等. 黃金香柳枝葉揮發性精油提取與分析[J]. 香料香精化妝品， 2009， 12（6）： 8-10.

[5] 瞿新華. 植物精油的提取與分離技術[J]. 安徽農業科學， 2007， 35（32）： 10 194-10 195， 10 198.

[6] 廖玉琴， 包清彬， 李松柏， 等. 檸檬精油提取工藝的優化及其GC-MS分析[J]. 食品與機械， 2012， 28（1）： 186-189.

[7] 張 艷， 仝其根. 桂皮精油的提取及其化學成分的GC-MS分析[J]. 中國農學通報， 2012， 28（9）： 264-269.

[8] Jia L H， Liu Y， Li Y Z. Rapid determination of volatile constituents in safflower from Xinjiang and Henan by ultrasonic-assisted solvent extraction and GC-MS[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis， 2011， 1（3）： 213-218.

[9] G A Cardoso-Ugarte， G P Juárez-Becerra， M E SosaMorales， et al. Microwave-assisted extraction of essential oils from herbs[J]. Journal of Microwave Power and Electromagnetic Energy， 2013， 47（1）： 63-72.

[10] 鄭云武， 黃元波， 鄭志繹， 等. 正交試驗法優化橡膠籽油的提取工藝[J]. 生物質化學工程， 2012， 46（2）： 21-24.

[11] Aboutabl E A， EI Tohamy S F， De Footer H L， et al. A comparative study of the essential oils from three Melaleuca species growing in Egypt[J]. Flavour and Fragrance Journal， 1991， 6（2）： 139-141.

[12] Richard J Brennan， Sridevi Kandikonda， Achot P Khrimian， et al. Saturated and monofluoro analogs of the oriental fruit fly attractant methyl eugenol show reduced genotoxic activities in yeast[J]. Mutation Research， 1996， 369（3-4）： 175-181.

[13] 孫 陽， 張淑穎. 甲基丁香酚揮發物對桔小實蠅成蟲的引誘作用[J]. 安徽農業科學， 2008， 36（20）： 8 685-8 687.

[14] 李周文婷， 曾 玲， 梁廣文， 等. 不同溫度和光照強度甲基丁香酚對桔小實蠅雄蟲的誘捕率[J]. 環境昆蟲學報， 2010， 32（3）： 363-368.

[15] Dr Merih Kivanc. Antimicrobial activity of “Cortük” （Echinophora sibthorpiana Guss.）spice， its essential oil and methyl-eugenol（Short communication）[J]. Food/Nahrung， 1988， 32（6）： 635-637.

[16] Packiavathy I A S V， Agilandeswari P， Musthafa K S， et al. Antibiofilm and quorum sensing inhibitory potential of Cuminum cyminum and its secondary metabolite methyl eugenol against Gram negative bacterial pathogens[J]. Food Research International， 2012， 45（1）： 85-92.

[17] Bhatia S P， Wellington G A， Cocchiara J， et al. Fragrance material review on methyl cinnamate[J]. Food and Chemical Toxicology， 2007， 45（1）： S113-S119.

[18] Nils Bülow， Wilfried A Konig. The role of germacrene D as a precursor in sesquiterpene biosynthesis： investigations of acid catalyzed， photochemically and thermally induced rearrangements[J]. Phytochemistry， 2000， 55（2）： 141-168.

責任編輯：沈德發