一起雞新城疫的診斷研究

摘 要：甘肅某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的雞群突然發(fā)病，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和病理解剖觀察，初步分析診斷為雞新城疫。然后采集病死雞腦組織，提取總RNA，針對新城疫F基因全序列設(shè)計引物，進行RT-PCR診斷，結(jié)果為新城疫陽性，對F0位點的氨基酸序列分析，符合新城疫強毒序列特點，確定雞場為新城疫感染。

關(guān)鍵詞：雞新城疫；診斷；RT-PCR

中圖分類號：S855 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）12-0054-02

雞新城疫（Newcastle Disease，ND）又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。剖檢特征為敗血癥變化、消化道黏膜出血和潰瘍。死亡率高，對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴重。本病首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞，不久又在英國新城發(fā)現(xiàn)，世界各國均有流行記載。有強毒株和弱毒株兩類。病毒分為低毒力型（即緩發(fā)型）、中等毒力型（即中發(fā)型）和強毒力型（即速發(fā)型）三型。多數(shù)高強度毒力株常屬嗜內(nèi)臟型新城疫病毒。雞科動物都可患本病。家雞最易感，雛雞比成年雞易感性更高。珠雞、火雞、雉、孔雀也能感染。鴨、鵝對本病有抵抗力。哺乳動物對本病有強大抵抗力，但人偶有感染而患結(jié)膜炎。健康雞與病雞（包括隱形感染和潛伏期的雞）接觸是本病傳播的主要途徑。病毒可通過口腔、鼻、眼結(jié)膜和泄殖腔等部黏膜及皮膚創(chuàng)傷侵入機體而感染，發(fā)病率和死亡率均較高。

2013年8月，甘肅某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的雞發(fā)病，根據(jù)臨床癥狀并結(jié)合病理學(xué)檢查結(jié)果，初步確定為新城疫，經(jīng)采樣實驗室PCR診斷，確定為新城疫，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

甘肅某養(yǎng)雞場的病死雞。

1.1.2 器械、菌株及載體

常用剖解器械，E.coli DH5α菌株、BL21（DE3）菌購自天根生化科技有限公司，pMD-18T載體購自寶生物工程大連有限公司。PGEX-4T-1原核表達載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.3 試劑

T4 DNA連接酶、RNAiso Plus提取試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaq聚合酶、dNTP Mix、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司，小型質(zhì)粒提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 疫情調(diào)查

按照流行病學(xué)調(diào)查方法，調(diào)查發(fā)病情況，發(fā)病后的表現(xiàn)，雞群飼養(yǎng)管理狀況，發(fā)病后的處理辦法以及周邊環(huán)境雞場有無相應(yīng)的疫情等。

1.2.2 病理檢查

按照家禽尸體剖檢技術(shù)進行病理學(xué)檢查。

1.2.3 RT-PCR診斷

1.2.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank NDV-F的基因序列，利用DNASTAR軟件設(shè)計兩對引物用于擴增鴿Ⅰ型副粘病毒F基因，其中P1、P2用于RT-PCR擴增F基因，預(yù)期擴增大小為1 662 bp。

P1：5’-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3’

P2：5’-TCATGCTCTTGTAGTGG-3’

1.2.3.2 RT-PCR擴增F基因

無菌采集四只病死雞的腦組織，參照RNAiso Plus提取試劑說明書提取新城疫的RNA，以P1和P2為引物，按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書進行RT-PCR擴增，PCR程序為：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，共30個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL～10 μL于10 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.2.3.3 F基因的克隆

將F基因PCR產(chǎn)物電泳切膠回收，取PCR產(chǎn)物4 μL，pMD-18T載體0.5 μL，Solution I4.5 μL，混勻，16 ℃連接4 h。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，并在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取陽性菌落進行PCR鑒定并測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

個別雞沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀就突然死亡。大多數(shù)病雞表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，病初，病雞精神萎靡、羽毛粗亂，垂頭、雙翅下垂、雙眼微閉、似昏睡狀；雞冠和肉髯呈紫紅色；以后出現(xiàn)水樣腹瀉、糞便呈黃綠色、常帶有血液；體溫升高到44 ℃、口渴、食欲減退或廢絕；隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、鼻孔周圍可見粘液性分泌物、常有伸頸和張口呼吸癥狀、并有喘鳴和尖叫聲；口角也可見粘性分泌物，病雞表現(xiàn)出搖頭、張口和吞咽動作；嗉囊內(nèi)充滿液體內(nèi)容物，倒提時常有大了量酸臭液體從口內(nèi)流出；多于發(fā)病后1 d～2 d內(nèi)死亡；耐過者常表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，如四肢麻痹、共濟失調(diào)、肌肉震顫、痙攣和轉(zhuǎn)圈等。

2.2 病理剖檢變化

個別突然死亡的病例，剖檢往往見不到任何眼觀病變，有時僅見漿膜下、腹膜、胸骨部漿膜、腸系膜附著處及呼吸道黏膜有少數(shù)針尖大出血點。

癥狀明顯的病例主要表現(xiàn)為全身漿膜、黏膜及組織內(nèi)均有出血點，以呼吸道和消化道最為明顯。其中心外膜尤其冠狀溝部、腺胃漿膜、軟骨漿膜多呈噴灑狀出血點，消化道黏膜從口腔到泄殖腔普遍有較嚴重的出血，多呈點狀或彌漫性出血，腦膜有時也見出血點。

大多數(shù)雞嗉囊充滿酸臭的稀薄液體。

腺胃的特征變化是出血和潰瘍。胃腔空虛，黏膜表面覆有多量透明或膿性粘液，腺胃乳頭間黏膜上有小型點狀出血，有的形成潰瘍，隆起于黏膜表面，表面覆以米粒大的黃白色病灶，小潰瘍表面覆有金黃色或褐色撒康樣痂。

小腸除了黏膜有嚴重出血外，還可見大小不等的局灶性壞死和潰瘍。切開腸管的病變部位，有明顯的潰瘍，表面呈白、灰、褐色樣的結(jié)節(jié)樣病變。大腸的大潰瘍發(fā)生于盲腸扁桃體，特征是盲腸扁桃體出血及潰瘍。兩側(cè)的盲腸病變相對稱。從漿膜面便可看到該部腸壁呈紡錘形隆起，大如黃豆，黏膜深部的出血壞死灶也隱約可見。切開腸腔檢查，其病變與小腸基本一致。直腸病變也比較明顯，輕者通常呈卡他性炎癥，黏膜腫脹充血，表面附有粘液。重者則有出血點和壞死灶。這種壞死灶與盲腸中的小壞死灶相仿，但有時也可相互融合成為較大潰瘍。

鼻腔、喉頭、氣管和支氣管中常蓄積多量污黃色黏液，喉頭或氣管黏膜見有小出血點。

2.3 RT-PCR檢測

2.3.1 F基因的RT-PCR擴增

以提取的病死雞腦組織總RNA為模板，以P1和P2為引物，PCR擴增后電泳檢測，可見約1 662 bp的片段，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。

2.3.2 F基因的克隆與測序

將RT-PCR擴增的F基因與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選陽性菌落提取質(zhì)粒，將含F(xiàn)基因的重組質(zhì)粒送上海英俊生物科技有限公司測序鑒定。測序結(jié)果表明：擴增的F基因的大小為1 662 bp，該片段與預(yù)期結(jié)果完全相符，為完整的F基因序列。對F基因112～117F0蛋白裂解位點的氨基酸序列進行分析，結(jié)果F0蛋白裂解位點的氨基酸序列組成為：112R-R-R-K-R-F117，與強毒株序列相符，表明雞場為新城疫強毒株感染。

3 討論

雞新城疫的病理變化依病程經(jīng)過不同而表現(xiàn)各異，可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型，唯典型病變只見于急性型，其他各型缺乏特征病性變化。最急性型病例往往未及時發(fā)現(xiàn)癥狀就突然死亡，剖檢往往見不到任何病變。急性新城疫剖檢特征為敗血癥變化，消化道黏膜出血和潰瘍。亞急性經(jīng)過時，敗血癥變化和消化道變化很輕微甚至缺乏，常見頭、頸、胸等部位的皮下和咽喉頭周圍的結(jié)締組織水腫，以及纖維素性胸膜炎和心包炎。慢性經(jīng)過的新城疫缺乏敗血癥變化和消化道變化，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生明顯的非化膿性腦脊髓炎，臨床上常呈現(xiàn)腿或翅膀麻痹、頭頸歪斜等神經(jīng)癥狀，有時發(fā)生支氣管炎或支氣管肺炎。臨床上應(yīng)注意新城疫與禽流感、雞霍亂等疫病的鑒別診斷。雞新城疫、禽流感和雞霍亂都是急性傳染病，臨床癥狀和剖檢變化方面有某些相似，急性新城疫不同于禽流感和雞霍亂的最突出的特點在于消化道從口腔到泄殖腔黏膜都有出血，腺胃錐狀突起的壞死灶和環(huán)狀出血，腸粘膜有規(guī)律的大潰瘍灶和無規(guī)律的小潰瘍壞死灶，并伴有非化膿性腦脊髓炎；禽流感時表現(xiàn)為雞冠、眼瞼、肉髯水腫，邊緣出現(xiàn)紫黑色壞死斑點，腿部鱗片有紫黑色出血斑，十二指腸及小腸黏膜有片狀或條狀出血，卵泡充出血，紫黑色，卵泡變形，破裂，卵黃液流入腹腔，導(dǎo)致卵黃性腹膜炎。雞霍亂時肺臟往往有明顯變化，如肺充血、水腫、纖維素性肺炎、胸膜腔和心包腔有漿液纖維性滲出物，肝有壞死點等變化。新城疫一般通過臨床癥狀和剖檢病變可作出初步診斷，單要確診，則需要進一步的方法，對于新城疫的診斷方法目前大體可分為兩種：血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。在本起雞場的疑似新城疫病例中，我們采集病死雞的腦組織提取總RNA，根據(jù)F基因序列設(shè)計一對引物，用RT-PCR方法進行確診，并把F基因進行克隆，測序。

新城疫病毒為副粘病毒科腮腺炎病毒屬禽副粘病毒Ⅰ型的唯一成員，為有囊膜的負鏈RNA病毒，為單股負鏈RNA病毒，病毒離子含有六個基因編碼6個主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）構(gòu)成囊膜外表面的纖突、是新城疫的功能性糖蛋白，在致病和免疫應(yīng)答過程中起重要作用。尤其是F基因的遺傳變異與新城疫的變異和流行密切相關(guān)，F(xiàn)基因是病毒毒力強弱和免疫原性的主要決定因素，是新城疫分子流行病學(xué)研究的首選基因。F蛋白裂解位點（112-117位的氨基酸）的氨基酸順序是決定新城疫病毒毒力的關(guān)鍵。強毒株的切割順序一般為112RQRK/RRF117；而弱毒株的通常為112GRK/QGRL117。這起雞場感染的新城疫F蛋白裂解位點的氨基酸序列為：112R-R-R-K-R-F117，與強毒株序列相符。

新城疫的預(yù)防工作是一項綜合性工程，飼養(yǎng)管理，防疫，消毒，免疫及檢測五個環(huán)節(jié)缺一不可。不能單純依賴疫苗來控制疾病。家強飼養(yǎng)管理和獸醫(yī)衛(wèi)生，注意飼料營養(yǎng)，減少應(yīng)激，提高雞群的整體健康水平，特別要加強全進全出的封閉式飼養(yǎng)制，提倡育雛、育成和成年雞分場飼養(yǎng)方式。嚴格防疫消毒制度，杜絕強毒污染和入侵。建立科學(xué)的適合于本場的免疫程序，充分考慮母源抗體水平，疫苗種類及毒力，最佳劑量和接種途徑，雞種和年齡。堅持定期免疫檢測，隨時調(diào)整免疫計劃，使雞群始終保持有效的抗體水平。一旦發(fā)生非典型性雞新城疫，應(yīng)立即隔離和淘汰早期病雞，全群緊急接種LoSota（Ⅳ系）活毒疫苗，必要時也可考慮注射Ⅰ系活毒疫苗。如果把Ⅳ系活苗與ND油乳劑滅活苗同時應(yīng)用，效果更好。對發(fā)病雞群投服多維和適當(dāng)抗生素，可增加抵抗力，控制細菌感染。