低溫乙醇法中提高人血白蛋白收率的探索

摘要： Kistler-Nitschmann改良低溫乙醇法[1]工藝，是人血白蛋白工業化生產中使用最為普遍的工藝，該工藝可制備出符合臨床要求的人血白蛋白。為了提高人血白蛋白收率，對低溫乙醇法中的部分工藝參數進行了改進。調查12批次原料血漿的白蛋白收率和12批次成品的濁度和純度，結果顯示工藝參數的改進不影響人血白蛋白成品質量屬性的穩定，同時，人血白蛋白的收率也有所提高。

關鍵詞：低溫乙醇法；人血白蛋白；收率

人血漿中已發現的蛋白成分大約有100多種，其中已經分離提純和性質明了的有60余種，大約20種已經有臨床用途。血漿蛋白的分離，是利用不同蛋白成分的理化性質，如分子大小、密度高低、表面結構等的區別，將其相互分開。

低溫乙醇法的原理和要點：生產過程中，往原料血漿的制品中加入乙醇，降低水分子的活度，降低溶液的介電常數，從蛋白分子周圍排代水分子，使蛋白分子和蛋白分子之間通過極性基團的相互作用在范德華引力下發生凝聚，從而沉淀下來。低溫乙醇法中主要控制5變因素：蛋白濃度、酸堿度、離子強度、溫度和乙醇濃度。在前4變因素都一致的情況下，乙醇的沉淀作用取決于蛋白分子的大小。低溫乙醇法中，乙醇濃度逐步提高，蛋白分子按大小順序先后沉淀。人血白蛋白作為血漿主要成分中分子量最小的一種，是在最后一步的沉淀反應中分離出來的[2]。

人血白蛋白采用Kistler-Nitschmann改良低溫乙醇法的工藝流程（其中工藝配方和工藝參數已處理），見圖1。

低溫乙醇法的工業化生產中，人血白蛋白收率的呈現出不穩定的狀態。現就提高人血白蛋白收率工作做簡要介紹。

1 資料與方法

1.1原料血漿 來自成都蓉生藥業有限責任公司下屬漿站，保存-40℃～-30℃，其質量符合《中國生物制品規程》中原料血漿采集規程。

1.2試劑與材料 雙縮脲試劑；乙酸纖維素膜片、染色液、脫色液、透明液。

1.3主要儀器 紫外分光光度計（含540nm波長）、2100N濁度儀、Microtech648ISO全自動電泳儀。

1.4蛋白濃度測定 原料血漿合并后蛋白濃度的測定，以白蛋白標準品作為標準，采用\"雙縮脲法\"測定。

1.5濁度測定 成品濁度的測定，以2100N濁度儀配套的濁度標準溶液為標準，采用\"濁度儀法\"測定。

1.6純度測定 成品純度的測定，使用Microtech648ISO全自動電泳儀配套試劑，采用\"乙酸纖維素薄膜電泳法\"測定。

2 結果

采用Kistler-Nitschmann改良低溫乙醇法進行人血白蛋白的制備。選擇12批次的血漿和成品，作為研究對象，進行相關數據的收集和分析。

2.1調整緩沖液離子濃度對FV沉淀回收率的影響 每個批次原料血漿投漿后，采用\"雙縮脲法\"對血漿蛋白濃度進行測定，結果見表1。其中，批號091～096未做工藝改進，批號097～102采取了改進兩步工藝的措施。

血漿總蛋白濃度高，最終白蛋白的收率也較高[3]，這之間的關聯是明顯的。為了降低此類差異對收率的影響，并從回收血漿和穩定化生產角度出發，均會用0.9%氯化鈉溶液調整每個投漿批次的血漿蛋白濃度到一定范圍。

為了提高FV沉淀收率，對低溫乙醇法的工藝做了兩步調整：①采用氯化鈉溶液提高FI+II+III緩沖液的離子濃度；②采用乙酸鈉溶液提高FIV緩沖液離子濃度。比較工藝改進前后FV沉淀回收率的趨勢，可看出，工藝改進后生產批號的Fv沉淀回收率有明顯地上升趨勢，見圖2。

2.2調整緩沖液乙醇濃度對白蛋白收率的影響 產品批號的Fv沉淀精制，批號045～050未做工藝改進，批號051～056中，精確控制Fv精制緩沖液中65%乙醇用量。后續工藝未做調整，成品包裝完成后，對白蛋白收率進行計算，見表2

批號051～056中，精確控制Fv精制緩沖液乙醇用量，最終使精制Fv溶液中乙醇濃度更加準確，達到12%[1]。比較工藝改進前后，白蛋白收率有提高，見圖3。

2.3工藝改進對人血白蛋白成品質量的影響 批號045～056共12批的人血白蛋白成品純度、濁度見表3。

表3中的數據顯示出，工藝改進前后，采用\"乙酸纖維素薄膜電泳法\"測定人血白蛋白成品的純度，結果顯示純度均>98%，優于白蛋白含量不低于蛋白總量96%的標準；采用\"濁度儀法\"測定人血白蛋白成品濁度，結果顯示濁度趨于穩定。

3 討論

本文中各批號血漿進行投漿操作后，均用0.9%氯化鈉溶液調整其血漿蛋白濃度到一定范圍，以避免制品溶液中蛋白濃度較大，而引起的多種蛋白共沉淀，避免成品產量和質量的下降。

工藝改進中調整制品的離子濃度，是因為離子濃度的微小增加，即可引起蛋白質溶解度的極大變化；FI+II+III緩沖液中離子強度的增加，是為了使FI+II+III沉淀中白蛋白含量降低，提高Fv沉淀回收率；FIV緩沖液中離子強度的增加，是為了使FIV沉淀中白蛋白含量降低，提高Fv沉淀回收率；兩步工藝調整，存在一定的風險，都可能增加制品溶液中雜蛋白的溶解度，最終可能影響人血白蛋白成品的純度、濁度等質量屬性。

工藝改進中調整Fv精制溶液的乙醇濃度，是因為乙醇濃度是影響溶液中白蛋白溶解度的因素之一，其精確控制對穩定Fv精制溶液中白蛋白的溶解度有重要意義，避免乙醇濃度的波動，造成白蛋白收率的波動。該工藝調整，目的是為了提高白蛋白收率，但是也存在一定風險，Fv精制工藝中乙醇濃度過低，不能有效沉淀雜蛋白，影響白蛋白純度，巴氏滅活過程中變性的雜蛋白與白蛋白共價結合，引起白蛋白的聚合；反之，Fv精制工藝中乙醇濃度過高，白蛋白被沉淀，影響白蛋白收率。

針對工藝改進中存在的風險，對人血白蛋白成品的純度、濁度含量進行檢測。檢測結果表明，在人血白蛋白成品質量屬性穩定的同時，工藝改進對人血白蛋白收率的提高有明顯的作用。

參考文獻：

[1]Kistler P，Nitschmann Hs.Large scale production of humanplasma fractions [J].Vox Sanguinis，1962，414.

[2]浦奕奕.低溫乙醇法在人血白蛋白工業化生產中的應用[J].考試周刊，2008，3：236-237.

[3]劉驍宇，周昌華，楊昌俊，等.低溫乙醇法工藝中影響白蛋白收率的若干因素探討[J].中國輸血雜志，2001，14（6），355-357.編輯/哈濤