P16、Ki—67和Bcl—2在宮頸上皮內瘤變中的表達及應用

摘要：目的 探討P16、Ki-67、Bcl-2抗體在宮頸上皮內瘤變（CIN）中的表達及應用價值。方法 用快捷免疫組化染色法檢測30例正常宮頸組織和66例CIN中p16、Ki-67和Bcl-2的表達，分析比較兩組的標記結果。結果 CIN中p16、Ki-67、Bcl-2的陽性率顯著高于正常宮頸（P﹤0.05），CINⅡ-Ⅲ的表達率顯著高于CINⅠ（P﹤0.05）。結論 P16、Ki-67和BCL-2抗體聯合標記可作為病理診斷CIN和區分級別的重要參考指標。

關鍵詞：宮頸上皮內瘤變；CIN；p16；Ki-67；Bcl-2；病理診斷；組織芯片

宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia， CIN）是宮頸癌的癌前病變。根據鱗狀上皮異型增生的程度分為CINⅠ、CINⅡ和CIN Ⅲ三個級別[1，2]。上述病變在臨床檢查中無法區分，必須通過活檢病理診斷才得以確診。及早發現CIN并準確進行分級，及時采取相應治療措施是預防宮頸癌的有效方法。臨床恰如其分地治療有賴于病理恰當的分級。由于病理診斷是以顯微鏡形態學為基礎的，尚缺少客觀標準，而且宮頸活檢常常是破碎的小標本，病理診斷誤差在所難免。如果有一些敏感和特異性的免疫組化標記物用于輔助診斷，可提高診斷質量，在避免過度治療的同時減少漏診。本文旨在能找到一些有價值的免疫組化指標應用于CIN的診斷和分級，為臨床治療方案選擇提供可靠依據。

1資料與方法

1.1一般資料 由美國泛普生物技術有限公司（PANTOMICS Inc，桂林）提供組織芯片（批號CIN1021）。本文入選病例組織芯片均達到優良級，即：樣本芯粒大小均勻；陣列無皺褶；鏡下細胞結構清晰；著色定位明確。在同一組織芯片中布陣96例，對照組（正常宮頸或僅輕度慢性炎）30例。CIN66例（Ⅰ28例、Ⅱ18例、Ⅲ20例）對照組年齡29～52歲，平均43.3歲，CIN組年齡25～73歲，平均44.6歲。均有臨床及病理診斷資料。免疫組化試劑P16、Ki-67Antigen、Bcl-2由福州邁新生物技術開發有限公司配套提供。

1.2染色方法和質量控制 采用快捷免疫組化染色方法對組織芯片進行染色，染色步驟按說明書進行。為了控制制作質量，設置了陽性和陰性對照片。用已知的陽性組織切片做陽性對照，同時使用PBS代替一抗體作為陰性對照片。另外用一張芯片進行常規HE染色以作對照。操作由桂林醫學院附院免疫組化實驗室技師完成。

1.3結果判讀標準 顯微鏡下觀察芯片內所有上皮細胞，漿或核內呈深棕黃色細小顆粒，定位明確，明顯高于背景色者為陽性細胞。p16陽性表達定位于細胞漿和/或細胞核，無細胞著色為（-），陽性細胞占鱗狀上皮≤10%為（+），陽性細胞占鱗狀上皮≥50%為（+++），位于兩者之間為（++）；Ki-67陽性標記部位在細胞核，陽性細胞僅位于鱗狀上皮基底層及副基底層者為（-），陽性細胞占鱗狀上皮下1/3為（+），陽性細胞占鱗狀上皮1/3～2/3之間為（++），超過2/3-至全層為（+++）；Bcl-2陽性標記部位在細胞膜和細胞漿，陽性細胞僅位于鱗狀上皮基底層及副基底層為（-），位于鱗狀上皮基底及副基底層以上≤10%為（+），位于鱗狀上皮基底及副基底層以上超過2/3-至全層為（+++），位于以上兩者之間為（++）。

1.4 統計方法 應用SPSS18軟件對檢測結果進行統計分析。觀察指標陽性率的差異使用交叉表（χ2，crossetabulation）進行雙側卡方檢驗，P=0.05為顯著界水平。

2結果

2.1組織芯片評估 由桂林泛譜生物技術有限公司提供的組織芯片，圓形芯粒直徑1.1mm，排列整齊，無皺褶。免疫組化染色結果顯示鏡下芯片組織細胞結構清晰，棕黃色陽性顆粒定位明確，易于鏡下觀察判斷。組織芯片符合質量要求。

2.2各指標免疫組化結果比較，見表1～表3。

3討論

近年的研究表明[1，2]，宮頸癌的形成主要由HPV（人乳頭狀瘤病毒）感染、細胞凋亡的抑制等多基因參與的復雜過程。宮頸鱗狀上皮內瘤變（CIN）是宮頸癌的癌前病變，其發生與HPV感染密切相關。HPV感染到宮頸癌的發生多經歷 CINⅠ（低度病變）- CINⅡ-Ⅲ（高度病變）的階段。及早準確地發現宮頸鱗狀上皮內瘤變，并進行恰當的分級至關重要，既達到了預防宮頸癌的發生又避免了過度地治療。CIN I指鱗狀上皮輕度不典型增生，CINⅡ指鱗狀上皮中度不典型增生，而CIN Ⅲ則包含了鱗狀上皮重度不典型增生和原位癌。CIN Ⅰ大多數為HPV一過性感染，是一種不穩定的狀態，大多數可被機體免疫系統清除，容易逆轉至正常，具有較高的自然轉陰率[3]。臨床上多采取比較保守的治療方案，以隨診觀察為主。這對于將來想生育的患者尤為重要。而CINⅡ-Ⅲ被視為高度病變。由于高度病變發展為癌的幾率較高，臨床上則視患者年齡及對生育的要求可采取宮頸LEEP錐形切除或子宮單純切除等治療措施。

抑癌基因蛋白P16是一種重要的多腫瘤抑制基因。目前研究表明在高級別CIN和高危型HPV感染的宮頸癌中高表達，P16高表達可間接提示HPV感染[4]。本文觀察到P16表達強度與CIN分級密切相關。在正常宮頸組織中陽性率僅6.7%，而在CIN病變中陽性率為65.2%，差異有顯著意義。而在宮頸CINⅡ和CIN Ⅲ中有廣泛和較高表達，其中CIN Ⅲ的中-強陽性率達高100%。借助P16的陽性強度，有助于診斷CIN病變以及對CIN病變進行客觀適當的分級。隨著CIN級別的增高，P16表達亦增高。CINⅡ和CIN Ⅲ強陽性率明顯高于CIN Ⅰ（P<0.05），在CIN 診斷及分級中是較可靠的標記抗體，可提高高級別CIN的檢出率。許多研究資料也支持這一觀點。P16抗體陰性可作為排出CIN病變的有價值的指標。P16彌漫陽性者其風險明顯高于P16陰性者，P16用于CIN病變的監測具有較高的靈敏度和特異度[3-7]。

Ki-67核抗原是針對處于增值周期的人類細胞核抗原，被視為較可靠且全面反映細胞群體增殖活性的指標。觀察Ki-67表達的陽性指數，可了解宮頸上皮增生的程度。國內外已有研究表明[5]，Ki-67免疫定量是判斷CIN級別的敏感指標，也是預測CIN進展的指標。本文作者觀察到，正常宮頸上皮Ki-67陽性細胞主要集中在基底層和副基底層，隨著異型細胞增生，Ki-67陽性細胞增多、范圍擴大，超出上皮基底層和副基底層以上的范圍，呈明顯上移趨勢。Ki-67增值指數越高CIN級別越高，明顯反映異型細胞增生的程度，因而可用于隨訪病例活檢的觀察指標之一。

原癌基因BCL-2是細胞凋亡調控基因。其生物學功能為延長細胞的生命周期并增強細胞對凋亡刺激因素的耐受性而達到抗凋亡的作用，是較肯定的細胞凋亡調控基因。BCL-2過度表達抑制細胞的凋亡，使受損的細胞獲得永生性并不斷增殖發展為腫瘤。一些研究提示[8]，BCL-2在正常宮頸組織中的陽性率顯著低于CIN組和宮頸癌組。本研究BCL-2在對照組的陽性率為20%，明顯低于陽性率為83.3%的CIN組（P<0.05）。表明BCL-2與宮頸癌的發生有一定關系。隨著CIN級別增高BCL-2陽性率顯著增高，并與P16和Ki-67呈正相關。

綜上所述，在CIN鑒別診斷和分級中如果能采取P16、Ki-67和Bcl-2聯合標記，會更有助于病理診斷和分級，特別是對于活檢標本少，病變不典型的病例更具有實用性。

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