熒光定量PCR檢測(cè)HBV—DNA與ELISA方法測(cè)定乙肝血清標(biāo)志物相關(guān)性分析

【摘要】 目的 用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)乙型肝炎患者血清中HBV-DNA的含量，了解其與酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）測(cè)定乙肝血清學(xué)標(biāo)志物（乙肝兩對(duì)半）的關(guān)系。方法 采用RT-PCR方法和ELISA方法，分別檢測(cè)141例乙型肝炎患者血清中HBV-DNA含量和乙肝兩對(duì)半指標(biāo)。根據(jù)血清學(xué)標(biāo)志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）結(jié)果的不同模式，將141例患者分組。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者血清中存在高水平HBV-DNA，陽性率達(dá)98.1%（51/52）；HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平稍低，陽性率達(dá)80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平陽性率也達(dá)到了82.4%（28/34）。結(jié)論 ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半能提供乙肝感染的間接證據(jù)，而RT-PCR法檢測(cè)HBV-DNA準(zhǔn)確靈敏，能真實(shí)反映HBV感染、復(fù)制及病程變化，在乙肝診斷、治療及藥效評(píng)價(jià)方面有應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)；HBV-DNA；乙肝血清學(xué)標(biāo)志物

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.036

文章編號(hào)：1004-7484（2014）-04-1836-01

隨著對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）分子生物學(xué)研究的深入，以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）方法的普遍開展，目前對(duì)乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物的臨床意義已有了新的認(rèn)識(shí)。本文選取撫順市中心醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室2013年間的141例乙肝患者HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)其血清學(xué)標(biāo)志物不同模式將其分組進(jìn)行比較，現(xiàn)將分析結(jié)果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 為本院2013年1月至2013年11月住院及門診的經(jīng)臨床確診的乙型肝炎患者141例，男性87例.平均年齡46歲；女性54例，平均年齡44歲。

1.2 HBV血清學(xué)標(biāo)志物 檢測(cè)采用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法，ELISA試劑盒購(gòu)自（上海科華生物工程實(shí)業(yè)有限公司），操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.3 儀器設(shè)備 Rotor-GeneQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀（德國(guó)凱杰）。HBV-DNA提取和擴(kuò)增試劑盒來自凱杰生物技術(shù)有限公司。

1.4 RT-PCR檢測(cè) HBV-DNA方法采用煮沸裂解法，從血清中提取HBV—DNA。同時(shí)做陰性、臨界陽性、強(qiáng)陽性質(zhì)控品。4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均由試劑盒配置，HBV-DNA濃度依次為104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增，93℃2min，然后按93℃45s-55℃60s10個(gè)環(huán)，93℃30s-55℃45s30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)果由儀器自動(dòng)分析得出血清標(biāo)本的乙肝病毒量。該儀器檢測(cè)靈敏度為5×102lU/ml，大于該濃度為陽性結(jié)果。

1.5 定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法 將各組HBV-DNA定量結(jié)果分組統(tǒng)計(jì)，分為>106lU/ml組、103-106lU/ml組、<103lU/ml組和陰性組。計(jì)算各組樣本比例數(shù)。

2 結(jié) 果

141例血清標(biāo)本根據(jù)血清學(xué)標(biāo)志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）結(jié)果的不同模式分組，其HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 討 論

結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一組HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者血清中存在高水平HBV-DNA，陽性率達(dá)98.1%（51/52）；第二組HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平稍低，陽性率達(dá)80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb陽性組患者血清中HBV—DNA水平陽性率也達(dá)到了82.4%（28/34）。但各個(gè)組中HBV-DNA定量水平分布情況存在很大差別。第-組94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上，提示HBeAg與HBV-DNA的存在是完全-致的，二者具有相似的流行病學(xué)意義[1]。如此高的病毒載量，證明了乙肝兩對(duì)半呈大三陽模式的乙肝患者具有很強(qiáng)的傳染性。

HBcAb過去-直被認(rèn)為對(duì)乙肝病毒感染有保護(hù)作用，是預(yù)后良好的征象。本研究中第二組患者血清中HBV-DNA陽性率達(dá)80.8%，說明HBeAb的出現(xiàn)仍有病毒的復(fù)制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml，說明隨著HBeAg轉(zhuǎn)陰，病毒復(fù)制減少。有資料認(rèn)為，這種情況的復(fù)制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株變異所致，多發(fā)生在慢性肝炎[2]。第三組HBV-DNA陽性率與第二組相似，但HBV-DNA定量結(jié)果比第二組低，目前認(rèn)為是處于乙肝病毒感染恢復(fù)期或基因突變[3]。單項(xiàng)HBcAb陽性提示機(jī)體既往感染或急性感染的“窗口期”，出現(xiàn)這種模式時(shí)應(yīng)作RT-PCR進(jìn)行病毒定量加以區(qū)分。以上分析表明，血清乙肝兩對(duì)半陽性者，無論何種組合模式均存在病毒復(fù)制的可能[4]。

在技術(shù)上，RT-PCR采用熒光標(biāo)記和閉管檢測(cè)，克服了常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染所致假陽性的缺點(diǎn)，使結(jié)果具有極高的特異性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR結(jié)果時(shí)，還應(yīng)考慮以下因素：①RT-PCR的反應(yīng)體系復(fù)雜，易受多種因素影響。待測(cè)標(biāo)本的溶血、脂血、處理不當(dāng)都會(huì)導(dǎo)致其假陽性或假陰性；②RT-PCR只能檢測(cè)血中游離的HBV-DNA，當(dāng)病毒整合到肝細(xì)胞染色體上，隨同肝細(xì)胞一起復(fù)制、表達(dá)時(shí)，ELISA可出現(xiàn)陽性反應(yīng)，但血清中已沒有HBV顆粒存在，此時(shí)RT-PCR可為陰性；③當(dāng)患者感染的HBV-DNA發(fā)生突變，不能與熒光探針結(jié)合，RT-PCR為陰性，而ELISA可為陽性。ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的影響因素也較多，只能反映機(jī)體對(duì)乙肝病毒的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不能直接反映血清中的病毒含量。當(dāng)患者處于恢復(fù)期或既往感染，ELlSA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半可有多種模式，是否有乙肝需做RT-PCR進(jìn)行病毒定量。因此，在乙肝病毒感染的診斷上，二者有各自的優(yōu)點(diǎn)，不可互相替代。兩者相互結(jié)合，能為臨床診斷、治療方案的選擇及療效觀察提供更可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 張健，李寧，呂維紅，等.HBV-DNA定量測(cè)定對(duì)乙肝五項(xiàng)的評(píng)價(jià)意義[J].華中醫(yī)學(xué)雜志，2001，25（1）：15-17.

[2] 駱抗先.乙型肝炎的基礎(chǔ)和臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：1-6.

[3] 彭曉謀.利用免疫聚合酶鏈反應(yīng)探討HBgAb陰性/HBV—DNA陽性的形成原因[J].中華傳染病雜志，1999，17（1）：54-55.

[4] 謝志賢，譚愛國(guó)，何美懿，等.血清中乙型肝炎5項(xiàng)標(biāo)志表現(xiàn)模式與乙型肝炎病毒-DNA含量的關(guān)系.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志[J].2002，12（2）：81-83.

[5] 賴宏芳，付曉野，董玉琳，等.熒光探針定量PCR檢測(cè)HBV—DNA[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15（1）：18-19.