小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)研究

【摘要】 目的 探討小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblast MEF）體外培養(yǎng)的條件。方法 采用胰蛋白酶消化法，將小鼠胚胎制成細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)，摸索出最佳的胰蛋白酶濃度和消化時(shí)間及接種的細(xì)胞濃度。結(jié)果 采用0.0625%胰蛋白酶消化小鼠胚胎組織8min并以4×105個(gè)/ml濃度接種可獲得足量且高活力的MEF細(xì)胞。結(jié)論 該方法可獲得高活力MEF細(xì)胞，是一種可靠的MEF細(xì)胞培養(yǎng)方法。

【關(guān)鍵詞】 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；胰蛋白酶；分離

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.581

文章編號(hào)：1004-7484（2014）-04-2266-02

近幾年，誘導(dǎo)性多能干（Induced pluripotent stem，iPS）細(xì)胞技術(shù)[1]在形態(tài)和功能上均類似于胚胎干細(xì)胞（ES），它的生存需要培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上，這已經(jīng)是一種常規(guī)且穩(wěn)定的ES細(xì)胞培養(yǎng)方式。目前，在眾多細(xì)胞中，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF細(xì)胞）經(jīng)常被用于飼養(yǎng)層的制備[2]。本文采用胰蛋白酶消化的方法獲取MEF細(xì)胞，在既往研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)MEF細(xì)胞分離和培養(yǎng)的一些因素，并進(jìn)行鑒定，以獲得高質(zhì)量和高純度的MEF細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取清潔級(jí)昆明小鼠，7-8周齡雄性小鼠10只，4周齡雌性小鼠20只。將雄雌小鼠按1：2合籠，次日早晨檢查有陰栓者記為0.5d，選擇孕12.5-14.5d雌鼠獲取胎鼠。

1.1.2 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），兔抗小鼠Vimentin單抗、山羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。隔水式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力康設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 MEF細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取孕12.5-14.5d的昆明系清潔級(jí)雌鼠，引頸處死，在無菌條件下取出有胚胎的子宮，分離出胚胎，去除頭、四肢和內(nèi)臟，用無菌眼科剪將胎鼠剪成1mm3大小碎片，此種操作要在預(yù)溫的D-hanks液平皿中進(jìn)行。將胚胎碎片移入盛有4ml0.625%胰蛋白酶中，在37℃水浴中進(jìn)行消化，每次消化8min，共消化3次，收集消化后的細(xì)胞懸液，加適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，離心1000rpm5min×3次，計(jì)算細(xì)胞量。三次棄上清后，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，吹打均勻，調(diào)整濃度為4×105個(gè)/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后首次換液，之后隔日換液。3-5d傳代一次。

1.2.2 培養(yǎng)MEF細(xì)胞的鑒定利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)MEF細(xì)胞進(jìn)行鑒定。取培養(yǎng)第3代MEF細(xì)胞，以兔抗小鼠波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體為一抗，用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合法（SABC法）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒為MEF細(xì)胞。

1.2.3 MEF細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇；凍存液為90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO。將培養(yǎng)至鋪滿瓶底80%左右細(xì)胞按傳代的程序消化離心后，用凍存液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1x106個(gè)/ml，移至凍存管，于4℃放置10min，-20℃放置30min，-50℃過夜，后置-80℃保存。復(fù)蘇時(shí)將凍存管置37℃恒溫水浴箱中1-2min，盡快解凍。解凍后常規(guī)消毒凍存管，洗滌、接種細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

2 結(jié) 果

2.1 MEF細(xì)胞的取材孕13.5d的小鼠子宮呈串珠樣，內(nèi)有大小約2cm×1cm胚胎10個(gè)左右。

2.2 MEF細(xì)胞的光鏡觀察MEF在體外為貼壁生長型細(xì)胞。剛分離的MEF呈圓形，2h左右細(xì)胞開始貼壁，培養(yǎng)12h時(shí)大部分細(xì)胞貼壁，此時(shí)可見胞質(zhì)向外伸出偽足而形成梭形、多邊形等。72h后可形成細(xì)胞單層，消化傳代。

2.3 MEF細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定實(shí)驗(yàn)組用兔抗小鼠波形蛋白單克隆抗體作為一抗，用SABC法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)染色，細(xì)胞胞漿呈棕色染色為MEF細(xì)胞。

3 討 論

飼養(yǎng)層是特定的細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C阻斷有絲分裂處理后的單層細(xì)胞，目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室多采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層來分離培養(yǎng)iPS細(xì)胞[3]。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)過用絲裂霉素C處理后，已失去了分裂增殖的能力，但仍是活細(xì)胞，能分泌LIF因子，此因子具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖和抑制干細(xì)胞分化的功能。但胚胎成纖維細(xì)胞的生命期有限，為了能達(dá)到長期培養(yǎng)干細(xì)胞的要求，必須不斷的制備MEF飼養(yǎng)層，而MEF細(xì)胞作為干細(xì)胞的飼養(yǎng)層，細(xì)胞的質(zhì)量越高，其分泌LIF的能力越強(qiáng)，所以我們一般會(huì)選用前5代的細(xì)胞[4]。胎鼠日齡對(duì)原代MEF細(xì)胞的分離有一定影響，不同學(xué)者對(duì)分離原代MEF細(xì)胞的時(shí)間持不同看法：8-20d、11-16d、10-18d齡胎兒時(shí)間都可分離到原代MEF細(xì)胞[5]，我們從實(shí)驗(yàn)中得出10.5-15.5d的胎鼠均獲得原代MEF胞，13.5d-14.5d被認(rèn)為是最佳分離時(shí)間，采用胰蛋白酶酶消化法能在較短時(shí)間內(nèi)得到大量較純的MEF細(xì)胞。在用胰蛋白酶酶消化組織細(xì)胞時(shí)，既要離散細(xì)胞，又要防止消化液對(duì)細(xì)胞的過度損害，由于各實(shí)驗(yàn)室的條件不盡相同，胰蛋白酶消化時(shí)間也不完全一致。我們采用的是0.0625%的胰蛋白酶分次消化8min，共消化3次，得到足量且高活力的MEF細(xì)胞，與劉民等[6]和張怡等[7]的研究結(jié)果基本一致。

參考文獻(xiàn)

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[6] 劉民，李柏青.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和抑抑制[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2002，12（4）：215-219.

[7] 張怡，趙連三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2003，34（2）：344-346.