小鼠胚胎成纖維細胞的培養研究

【摘要】 目的 探討小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast MEF）體外培養的條件。方法 采用胰蛋白酶消化法，將小鼠胚胎制成細胞懸液接種培養，摸索出最佳的胰蛋白酶濃度和消化時間及接種的細胞濃度。結果 采用0.0625%胰蛋白酶消化小鼠胚胎組織8min并以4×105個/ml濃度接種可獲得足量且高活力的MEF細胞。結論 該方法可獲得高活力MEF細胞，是一種可靠的MEF細胞培養方法。

【關鍵詞】 小鼠胚胎成纖維細胞；胰蛋白酶；分離

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.581

文章編號：1004-7484（2014）-04-2266-02

近幾年，誘導性多能干（Induced pluripotent stem，iPS）細胞技術[1]在形態和功能上均類似于胚胎干細胞（ES），它的生存需要培養于飼養層上，這已經是一種常規且穩定的ES細胞培養方式。目前，在眾多細胞中，小鼠胚胎成纖維細胞（MEF細胞）經常被用于飼養層的制備[2]。本文采用胰蛋白酶消化的方法獲取MEF細胞，在既往研究的基礎上改進MEF細胞分離和培養的一些因素，并進行鑒定，以獲得高質量和高純度的MEF細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物取清潔級昆明小鼠，7-8周齡雄性小鼠10只，4周齡雌性小鼠20只。將雄雌小鼠按1：2合籠，次日早晨檢查有陰栓者記為0.5d，選擇孕12.5-14.5d雌鼠獲取胎鼠。

1.1.2 主要試劑及儀器DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），兔抗小鼠Vimentin單抗、山羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。隔水式二氧化碳培養箱（上海力康設備有限公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 MEF細胞的分離與培養取孕12.5-14.5d的昆明系清潔級雌鼠，引頸處死，在無菌條件下取出有胚胎的子宮，分離出胚胎，去除頭、四肢和內臟，用無菌眼科剪將胎鼠剪成1mm3大小碎片，此種操作要在預溫的D-hanks液平皿中進行。將胚胎碎片移入盛有4ml0.625%胰蛋白酶中，在37℃水浴中進行消化，每次消化8min，共消化3次，收集消化后的細胞懸液，加適量含10%胎牛血清的DMEM培養液，離心1000rpm5min×3次，計算細胞量。三次棄上清后，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液配制細胞懸液，吹打均勻，調整濃度為4×105個/ml接種于25cm2培養瓶中。于37℃5%CO2培養箱中培養；24h后首次換液，之后隔日換液。3-5d傳代一次。

1.2.2 培養MEF細胞的鑒定利用免疫細胞化學染色對MEF細胞進行鑒定。取培養第3代MEF細胞，以兔抗小鼠波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體為一抗，用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合法（SABC法）進行免疫細胞化學染色，用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對照。細胞質中出現棕色顆粒為MEF細胞。

1.2.3 MEF細胞的凍存與復蘇；凍存液為90%完全培養基+10%DMSO。將培養至鋪滿瓶底80%左右細胞按傳代的程序消化離心后，用凍存液懸浮細胞，調整細胞濃度為1x106個/ml，移至凍存管，于4℃放置10min，-20℃放置30min，-50℃過夜，后置-80℃保存。復蘇時將凍存管置37℃恒溫水浴箱中1-2min，盡快解凍。解凍后常規消毒凍存管，洗滌、接種細胞，于37℃、5%CO2培養箱中培養，隔日換液。

2 結 果

2.1 MEF細胞的取材孕13.5d的小鼠子宮呈串珠樣，內有大小約2cm×1cm胚胎10個左右。

2.2 MEF細胞的光鏡觀察MEF在體外為貼壁生長型細胞。剛分離的MEF呈圓形，2h左右細胞開始貼壁，培養12h時大部分細胞貼壁，此時可見胞質向外伸出偽足而形成梭形、多邊形等。72h后可形成細胞單層，消化傳代。

2.3 MEF細胞的免疫細胞化學染色鑒定實驗組用兔抗小鼠波形蛋白單克隆抗體作為一抗，用SABC法對細胞進行免疫化學染色，細胞胞漿呈棕色染色為MEF細胞。

3 討 論

飼養層是特定的細胞經絲裂霉素C阻斷有絲分裂處理后的單層細胞，目前，大多數實驗室多采用小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層來分離培養iPS細胞[3]。飼養層細胞經過用絲裂霉素C處理后，已失去了分裂增殖的能力，但仍是活細胞，能分泌LIF因子，此因子具有促進干細胞增殖和抑制干細胞分化的功能。但胚胎成纖維細胞的生命期有限，為了能達到長期培養干細胞的要求，必須不斷的制備MEF飼養層，而MEF細胞作為干細胞的飼養層，細胞的質量越高，其分泌LIF的能力越強，所以我們一般會選用前5代的細胞[4]。胎鼠日齡對原代MEF細胞的分離有一定影響，不同學者對分離原代MEF細胞的時間持不同看法：8-20d、11-16d、10-18d齡胎兒時間都可分離到原代MEF細胞[5]，我們從實驗中得出10.5-15.5d的胎鼠均獲得原代MEF胞，13.5d-14.5d被認為是最佳分離時間，采用胰蛋白酶酶消化法能在較短時間內得到大量較純的MEF細胞。在用胰蛋白酶酶消化組織細胞時，既要離散細胞，又要防止消化液對細胞的過度損害，由于各實驗室的條件不盡相同，胰蛋白酶消化時間也不完全一致。我們采用的是0.0625%的胰蛋白酶分次消化8min，共消化3次，得到足量且高活力的MEF細胞，與劉民等[6]和張怡等[7]的研究結果基本一致。

參考文獻

[1] Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell，2006，126（4）：663-676.

[2] Suemor H，N.Establishment of the embryo stem（ES）cell lines frommouse blastocysts effect of feeler cell layer.Develop Growth and Differ，1987，29∶133-137.

[3] Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M et al.Induction of pluripotent steCells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell，2007：28（3）76-79.

[4] Robert Lanza.Handbook of Stem Cells（Volume 1）：Embryonic Stem Cells[M].Northland：Elsevier Academic Press，2004，413-417.

[5] 安立龍，楊奇，馮秀亮，等.牛類胚胎干細胞的分離與克隆[J].中國農業科學，2001，34（5）：550-555.

[6] 劉民，李柏青.小鼠胚胎成纖維細胞的分離、擴增和抑抑制[J].中國實驗動物學雜志，2002，12（4）：215-219.

[7] 張怡，趙連三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纖維細胞的分離和培養[J].四川大學學報（醫學版），2003，34（2）：344-346.