非酒精性脂肪性肝病患者血清和肝組織胰腺衍生因子水平變化及意義

楊帆，李良平

·脂肪性肝病·

非酒精性脂肪性肝病患者血清和肝組織胰腺衍生因子水平變化及意義

楊帆，李良平

目的研究胰腺衍生因子（PANDER）在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者血清和肝組織的水平。方法納入經肝組織病理學活檢證實的NAFLD患者41例，以及20例正常人（NC），根據NAFLD活動性積分（NAS），將NAFLD患者分為單純性脂肪肝（NAFL）10例和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）31例。采用ELISA法檢測受試者血清和肝組織PANDER水平；采用實時熒光定量PCR法檢測肝組織PANDER mRNA水平的變化。另外，收集所有研究對象的人體測量學、生化及代謝指標，分別比較PANDER水平及與其相關性。結果NAFLD患者血清PANDER水平為（3.38±1.99）ng/ml，較NC組[（0.94±0.60）ng/ml]升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；NAFLD患者肝組織PANDER水平為（3.27±2.49）ng/ml，顯著高于NC組[（0.98±0.73）ng/ml，P＜0.05]；NAFL組和NASH組血清PANDER水平分別為（3.42±2.39）ng/ml和（3.36±1.91）ng/ml，肝組織PANDER水平分別為（2.33±1.52）ng/ml和（3.58±2.68）ng/ml，差異無統計學意義；血清PANDER與肝組織PANDER水平、BMI、腰圍、臀圍、TG、FBG、FINS、HMOA-IR的相關系數分別0.425、0.643、0.637、0.375、0.411、0.487、0.512和0.547，均呈正相關關系（P＜0.05），與IAI（r=-0.544）、HDL-C（r=-0.396）呈負相關（P＜0.05）；肝組織PANDER水平與血清PANDER水平、BMI和腰圍的相關系數分別為0.425、0.379和0.427，也呈正相關（P＜0.05）。結論PANDER可能通過影響胰島素抵抗和糖脂代謝參與NAFLD的發生與發展。

非酒精性脂肪性肝病；胰腺衍生因子；胰島素抵抗；脂質；糖代謝

【Key word】Nonalcoholic fatty liver diseases；Pancreatic derived factor；Insulin resistance；Lipid；Glucose metabolism

在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病機制中，胰島β細胞功能受損及胰島素抵抗起了很重要的作用，但它們與肝臟脂質沉積的關系仍不是很清楚。既往動物試驗研究顯示，外源性胰腺衍生因子（Pancreatic derived factor，PANDER）作為胰島分泌的細胞因子樣蛋白在小鼠肝組織過表達時，血清甘油三酯（TG）水平增加，同時肝脂質沉積也增加，通過干預后隨著肝臟脂質沉積減輕，PANDER表達也下降，推測PANDER可能參與了肝臟異常脂質沉積的過程[1]。然而，迄今為止，很多有關脂肪肝的研究只集中在體外試驗或動物試驗，臨床資料很少。本研究旨在檢測PANDER在脂肪肝病人血清和肝組織的水平，以及分析PANDER與一些糖脂代謝和胰島素抵抗的關系，初步探討PANDER在NAFLD發生發展機制中的作用,從而為臨床預防和治療NAFLD提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象自2012年3月～2012年9月于我院就診的符合中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組2010年發布的《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）》[2]診斷標準的、經肝臟病理學活檢證實為NAFLD患者，排除可導致脂肪肝的其他特定疾病和2周內服用過利尿劑、β受體阻滯劑、降脂藥和皮質激素等影響糖代謝和脂代謝藥物以及服用過保肝藥物治療的患者。病理學診斷參照美國國立衛生研究院非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）臨床研究網病理工作組指南，常規進行NAFLD活動度積分(NAFLD activity score，NAS)和肝纖維化分期[3]。在41例NAFLD患者中，根據NAS積分和肝纖維化分期，分為單純性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）患者10例，男6例，女4例。平均年齡（47.0±15.1）歲；NASH患者31例，男性19例，女性12例。平均年齡（45.8±9.4）歲。另招募年齡和性別相匹配的無肝臟疾患的志愿者（normal control,NC）20例，男性9例，女性11例。平均年齡（43.4±11.4）歲。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 人體測量學指標測量身高和體質量、腰圍、臀圍、血壓、計算體質量指數[BMI=體質量/身高2（Kg/m2）]、胰島素抵抗采用穩態模型（homeostatic model assessment index，HOMA-IR）[HMOA-IR= FPG（mmol/l）×FINS（uU/ml）/22.5]和胰島素敏感指數[IAI=1/（FPG×FINS）]。

1.3 血生化及代謝指標的檢測研究對象空腹（空腹時間＞8 h），清晨時于肘靜脈抽取空腹靜脈血，采用速率散射比濁法檢測血生化指標和血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；常規檢測乙型和丙型肝炎病毒抗原抗體（芬蘭Orion Diagnostica公司試劑）；采用化學發光微粒子免疫分析法測定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS，美國雅培公司試劑盒）；另取血，離心后，留取血清于Eppendorf管，置-80℃超低溫冰箱分裝保存，用于血清PANDER的統一測定。

1.4 血清PANDER測定采用ELISA法（上海藍基生物科技有限公司）。根據公式y=0.0752X+0.2146，計算出各樣本水平。

1.5 肝組織PANDER mRNA檢測行經彩超引導下經皮肝臟穿刺活檢術或腹腔鏡下肝臟活檢術，術前征得受試者同意并簽署知情同意書。將肝組織置于10%福爾馬林中固定，另取肝組織置于Trizol液中，立即放入-80℃超低溫冰箱保存。檢測PANDER基因引物設計：上游引物，5'-GTGGTGTTCGTGGTCTTCG-3'，下游引物，5'-TTTGGCGTACTTGCTTCTGC-3'；以GAPDH作為內參照，內參GAPDH引物設計：上游引物，5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'，下游引物，5'-GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA-3'。采用Trizol法提取肝組織總RNA（美國Invitrogen公司），每個樣本分別取總RNA 5 μl于EP管中，加入Buffer緩沖液1 μl，混勻充分后，將混合液加入預先配置好的1.5%瓊脂糖凝膠，另取DM200 Marker 5 μl于1.5%瓊脂糖凝膠、電泳。使用超微分光光度計測量每個樣本RNA水平，檢測各樣本D260/D280比值，計算RNA純度。以逆轉錄所得cDNA為模板，應用實時熒光定量PCR技術檢測PANDER及內參GAPDH mRNA水平。在反應完成后，記錄各反應孔的閾值循環數（threshold cycle），即Ct值。采用定量PCR法中的相對定量法計算各樣本的△Ct值=（CtPANDER-CtGAPDH），△△Ct=（CtPANDER-CtGAPDH）NAFLD-（CtPANDERCtGAPDH）NC，倍數的變化用F=2-△△Ct[27]法計算（F表示NAFLD患者肝臟組織中目標基因PANDER水平相對于NC肝臟組織的變化倍數）。

1.6 統計學處理采用SPSS19.0統計軟件包進行處理，所有數據先進行正態檢驗及方差齊性檢驗，對符合正態分布且方差齊性的或者經對數轉化后符合正態分布或者方差齊性的兩獨立樣本，以（±s）表示，采用t檢驗；對不符合正態分布或者方差不齊的兩獨立樣本，以[中位數（四分位數間距）]表示，采用秩和檢驗；PANDER與單個自變量的相互關系采用Spearman相關分析。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肝組織PANDER mRNA水平變化見圖1。

圖1 肝組織PANDER mRNA水平變化M：內參GAPDH；1、2：NC組；3、4：NAFL組；5、6：NASH組

2.2 NAFLD患者與正常人血清和肝臟PANDER水平比較見表1。與正常組比較，NAFLD組血清和肝組織PANDER水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 兩組血清和肝組織PANDER水平（±s）的比較

表1 兩組血清和肝組織PANDER水平（±s）的比較

①P＜0.01

例數血清PANDER（ng/ml）肝組織PANDER（ng/ml）NAFLD413.38±1.99①3.27±2.49①NC200.94±0.600.98±0.73

2.3 NAFL與NASH患者血清和肝臟PANDER水平比較見表2。兩組血清和肝組織PANDER水平無統計學差異（P＞0.05）。

表2 兩組血清和肝組織PANDER水平（±s）的比較

表2 兩組血清和肝組織PANDER水平（±s）的比較

例數血清PANDER（ng/ml）肝組織PANDER（ng/ml）NAFL103.42±2.392.33±1.52 NASH313.36±1.913.58±2.68

2.4 NAFLD組與NC組人體測量學指標、血生化和代謝指標的比較見表3、表4。與NC組比較，NAFLD組年齡、性別、身高差異無統計學意義（P＞0.05）；NAFLD組BMI、腰圍和臀圍明顯升高（P＜0.05）；血生化和血脂水平也明顯升高。

2.5 NAFLD組與NC組代謝指標的比較見表5。與NC組比較，NAFLD組FBG、FINS、HOMA-Index水平升高，IAI下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 NAFLD患者與正常人人體測量學指標[中位數（四分位數間距）]的比較

表4 NAFLD組與NC組生化指標（±s）的比較

表4 NAFLD組與NC組生化指標（±s）的比較

①P＜0.01

例數AST（U/L）ALT（U/L）TG（mmol/）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-（mmol/L）NFLD4139.60±14.33①46.95±21.431.94±0.95①4.59±0.712.65±0.60①1.22±0.28 NC2028.25±6.5646.95±21.431.30±0.984.01±0.471.96±0.471.26±0.19

表5 NAFLD組與NC組糖代謝指標（±s）的比較

表5 NAFLD組與NC組糖代謝指標（±s）的比較

②P＜0.01

例數FBG（mmol/L）FINS（Uu/ml）HOMA-IRIAI NAFLD415.79±1.15①8.82±6.34①2.31±1.68①0.02（0.02，0.04）①NC204.93±0.644.65±1.121.03±0.330.04（0.04，0.06）

2.6 血清和肝組織PANDER水平與臨床指標的相關性分析分析表明，血清PANDER與肝組織PANDER、BMI、腰圍、臀圍、TG、FBG、FINS、HMOA-IR呈正相關（P＜0.05），與IAI、HDL-C呈負相關（P＜0.05），與其他指標無明顯相關性（P＞0.05）；肝組織PANDER與血清PANDER、BMI、腰圍呈正相關（P＜0.05），與臀圍、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FGB、FINS和HOMA-IR無顯著相關性（P＞0.05），見表6和表7。

表6 血清PANDER與相關指標的相關性分析

表7 肝組織PANDER與臨床指標之間的相關性分析

3 討論

人PANDER基因在X染色體上定位于21q22、 D21S266和D21S1259之間，包含8個外顯子。PANDER啟動子具有組織特異性，在胰島和肝源性細胞系表達[4]，其蛋白相對高水平的表達于胰島β細胞[5]，與胰島素一起受到血糖的調節而共同分泌[6]。研究顯示，PANDER升高可以誘導胰島β細胞凋亡、抑制胰島素分泌和誘導肝細胞胰島素抵抗[7～9]。Yang et al用體外125I-PANDER競爭結合試驗證明，125I-PANDER呈劑量依賴性和時間依賴性地結合在肝細胞膜上，抑制胰島素信號轉導，誘導肝胰島素抵抗[10]。糖尿病db/db小鼠PANDER mRNA和蛋白質水平是非糖尿病db/m小鼠的2.5倍，循環血RANDER水平也明顯升高，使用4周胰島素增敏劑羅格列酮后，胰島的PANDER表達較前明顯下降[11]。在肥胖和高脂飲食小鼠肝臟，PANDER的表達顯著上升，而通過7周的強制減肥運動，隨著小鼠肝細胞脂肪變程度減輕，胰島素抵抗改善，肝臟PANDER表達量也隨之明顯降低[12]。通過siRNA介導的方法特異性敲除同時具有胰島素抵抗、高甘油三脂血癥和脂肪肝的db/db小鼠肝臟PANDER基因，結果發現，小鼠脂肪肝形態學明顯改善、肝組織中脂質沉積和血清甘油三酯水平顯著降低，Akt的活性增強，與胰島素信號轉導密切相關的蛋白激酶B和一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性以及FoxO1活性被明顯抑制。這些實驗結果表明，PANDER參與了機體糖脂代謝調節和肝脂肪變的發生。

除動物試驗及體外試驗外，PANDER是否也通過類似途徑參與人體NAFLD的發病機制呢？本實驗結果顯示NAFLD患者肝組織和血清PANDER水平較正常對照組升高，且肝組織PANDER與血清PANDER、BMI、腰圍呈正相關；血清PANDER與BMI、腰圍、臀圍、TG、FBG、FINS、HMOA-IR、IAI呈正相關。進一步提示PANDER可能是誘導機體發生胰島素抵抗（IR），調節脂質代謝的一個重要的內源性因素，從而參與了NAFLD的發病機制。

本實驗結果顯示NAFLD組血清PANDER與FINS和HOMA-IR明顯相關，表明PANDER可能參與誘導IR的發生過程，可能在NAFLD的發病機制中起著一定的作用。分析PANDER誘導機體發生IR的可能機制是：（1）重組PANDER可以與肝細胞膜上某種蛋白質結合，通過抑制胰島素受體酪氨酸磷酸化和胰島素信號轉導，誘導肝細胞胰島素抵抗的發生[13]；（2）過表達PANDER基因可以通過激活FoxO1的活性來抑制胰島素信號轉導，誘導IR的發生[14]。通過重組PANDER蛋白預處理或過表達PANDER均能以時間及劑量依賴的方式顯著地誘導人、大鼠及小鼠胰島細胞、β細胞系及α細胞系凋亡，并抑制β細胞分泌胰島素，從而誘導IR[10]；（3）PANDER高水平表達對肝臟及脂肪組織的胰島素敏感性有重要的調節作用[11]。本實驗結果顯示，NAFLD組FPG、TC、TG、LDL-C比正常對照組水平升高，且相關性分析顯示，血清PANDER與FBG成正相關（P＜0.05），提示PANDER過表達可能通過誘導機體發生糖代謝紊亂參與NAFLD的發病機制。PANDER可能參與調節脂質代謝，其機制可能是：（1）在PANDER過表達情況下，FoxO1在肝臟異常脂質沉積中起重要作用[15，16]。其中一個最主要的調節形式就是Akt-FOXO1途徑和Akt介導FOXO1磷酸化，使FOXO1轉錄活動停止[17]；（2）在過表達PANDER的小鼠，以過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）及固醇調節元件結合蛋白-1代表的脂質合成代謝通路中的轉錄因子和關鍵酶在轉錄和翻譯水平有顯著的增加，而在肝細胞與脂質分解代謝相關的轉錄因子和關鍵酶的蛋白表達則明顯被抑制。

總之，PANDER與糖脂代謝、胰島素抵抗和肝脂肪沉積關系密切，動物實驗也發現干預PANDER表達可以減輕肝組織異常脂質沉積，這為糖尿病、高脂血癥和非酒精性脂肪性肝病提供了一個新的靶點。

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（收稿：2014-01-14）

（校對：陳從新）

Serum and hepatic level of pancreatic derived factor in patients with non-alcoholic fatty liver diseases

Yang Fan，Li Liangping.Department of Gastroenterology，Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，Sichuan Province，China

ObjectiveTo explore the serum and hepatic level of pancreatic derived factor（PANDER）in patients with non-alcoholic fatty liver diseases（NAFLD）.MethodsForty-one patients with NAFLD confirmed by liver biopsy and 20 healthy persons were included in this study and the patients with NAFLD were further divided into NAFL group（n=10）and NASH group（n=31 cases）according to the NAFLD activity score（NAS）. Serum and hepatic level of PANDER were detected by ELISA method and hepatic level of PANDER mRNA was determined by real-time PCR.Anthropometry data，biochemical and metabolic parameters of all subjects were collected and compared between different groups.ResultsThe serum level and hepatic level of PANDER in patients with NAFLD were（3.38±1.99）ng/ml and（3.27±2.49）ng/ml，respectively，significantly higher than those in healthy controls[（0.94±0.60）ng/ml，（0.98±0.73）ng/ml），respectively，P＜0.05]；No significant difference in serum level[（3.42±2.39）ng/ml vs.（3.36±1.91）ng/ml]and hepatic level[（2.33±1.52）ng/ml vs.（3.58±2.68）ng/ml]of PANDER between patients with NAFL and NASH；Serum level of PANDER were positively correlated with hepatic level of PANDER（r=0.425），BMI（r=0.643），waist circumference（r=0.637），hip circumference（r=0.375，triglyceride（r=0.411），fasting blood glucose（r=0.487），fasting insulin（r=0.512）and homeostasis model assessment index（HOMA-IR，r=0.547，P＜0.05），and negatively correlated with insulin action index（r=-0.544）and high-density lipoprotein cholesterol（r=-0.396，P＜0.05）.Hepatic level of PANDER were positively correlated with serum PANDER level（r=0.425），body mass index（r=0.379）and waist circumference（r=0.427，P＜0.05）.Conclusion PANDER plays an important role in the pathogenesis of NAFLD by affecting body insulin resistance and glucose and lipid metabolisms.

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.009

610072成都市電子科技大學醫學院附屬四川省人民醫院消化科

楊帆，女，27歲,碩士研究生。主要從事肝病防治研究。E-mail:fanfancool.5128@yahoo.com.cn

李良平，E-mail:llp0131@medmail.com.cn