重度創傷性腦損傷致應激性肝損傷大鼠肝組織細胞色素P4502El水平變化

李靜，李毅，劉天會，尤紅，徐有青

·實驗性肝炎·

重度創傷性腦損傷致應激性肝損傷大鼠肝組織細胞色素P4502El水平變化

李靜，李毅，劉天會，尤紅，徐有青

目的研究重度創傷性腦損傷（TBI）誘導的應激性肝損害（HSI）大鼠肝組織細胞色素P4502El（CYP2E1）的變化。方法取40只健康雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術(A組)和TBI組，采用改良的Feeney自由落體撞擊法建立TBI大鼠模型；于顱腦致傷后6、12和24 h，檢測各組血清ATL、AST水平和丙二醛（MDA）水平變化，在光鏡下觀察肝臟組織學改變，采用RT-PCR和Western blot法分別檢測各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達。結果在TBI后6和24 h，各組大鼠血清ALT較基線水平[（42.2±8.1）U/L]明顯升高[分別為（83.0± 10.3）U/L和（1204.5±146.6）U/L，P＜0.01）]；傷后12 h血清AST較基線[（44.0±7.2）U/L]升高[（280.4±53.3）U/L，P＜0.01）]，于24 h達峰值[（790.3±114.5）U/L]；傷后6 h MDA較基線[（5.2±0.2）nmol/mg]明顯升高[（14.2±0.2）nmol/mg，P＜0.05]，24 h達峰值[（56.3±0.5）nmol/mg]；傷后24 h肝組織損傷最嚴重，可見肝小葉結構不清，肝竇明顯擴張，散在肝細胞點狀壞死，大量炎細胞浸潤；傷后6 h肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平較基線水平[分別為（0.28±0.02）和（61.68±0.60）]明顯增加[（0.89±0.05）和（120.24±1.22），P＜0.05]，在24 h達峰值[分別為（1.50±0.02）和（200.40±2.61），P＜0.01]。結論CYP2E1可能參與了TBI誘導的氧化應激反應，從而引起HSI。

肝損傷；應激反應；細胞色素P4502El；氧化應激；大鼠

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI），尤其是重度TBI后常發生應激性肝損害（hepatic stress injury，HSI）等內臟并發癥[1]。目前，HSI的發病機制尚未闡明，多認為是由內毒素血癥、炎癥性介質、氧自由基、細胞凋亡等多因素參與、多種炎癥介質共同作用的復雜的病理生理過程[2，3]。氧化應激是指因抗氧化機制受損引發的自由基和活性氧與蛋白、脂質或核酸等體內高分子反應，致使后者的結構、功能出現損害的狀態[4]。細胞色素P4502El（cytochrome P4502El，CYP2E1）可介導氧化應激，導致脂質過氧化[5～7]，而CYP2E1的表達受多因素調控，在酒精性肝病、非酒精性肝病中均有一定的作用。本研究探討了在重度創傷性腦損傷導致的大鼠應激性肝損傷中CYP2E1的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑健康雄性Wistar大鼠，體質量為200～250 g，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所動物中心提供。脂質過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。總RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、寡聚胸腺嘧啶引物、瓊脂糖均購自美國Promega公司。Taq酶和PCR分子量標準購自北京天為時代公司。兔抗大鼠CYP2E1多克隆抗體（ab53945）購自美國ABcam公司。zb-230辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。化學發光液購自美國Pierce公司。FuGENEHD轉染試劑盒購自德國羅氏公司。

1.2 TBI模型制備將40只Wistar大鼠隨機分為假手術組（A組）和TBI組（B組），再根據術后6 h、12 h和24 h分成B6、B12和B24組，每組大鼠10只。采用改良的Feeney[3]自由落體撞擊法建立TBI模型。應用3%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，俯臥位固定于顱腦立體定位儀上，取頭皮正中矢狀切口，用骨膜剝離器輕輕剝離骨膜，暴露左側冠狀縫及人字縫部，自人字縫前、中線左側2 mm處開窗，將撞桿系統置于硬膜外，撞擊面積為0.1 cm2，撞擊力度為20 N/cm2，將20 g砝碼從50 cm高度落下，致傷力約為100 kPa，相當于臨床重度腦損傷[5]，縫合頭皮。在假手術大鼠只開骨窗，不予落體撞擊。各組大鼠均于術后48 h處死，自左心室取血，取肝組織200 mg備檢。

1.3 血清ATL和AST檢測采用Reitman氏法檢測。

1.4 肝組織MDA檢測取肝組織勻漿，參照南京建成生物研究所提供的MDA測定試劑盒的操作步驟進行。

1.5 肝組織病理學檢查取大鼠肝臟組織，石蠟切片，HE染色，在光鏡下觀察組織學改變。

1.6 肝組織CYP2El mRNA檢測采用RT-PCR法，取肝組織200 mg，制備組織勻漿，提取總RNA，進行逆轉錄。設計CYP2El引物如下：上游：5’-TCATAGCCGACATCCTCTTC-3’，下游：5’-GTTGTGCTGGTGGTCTCTGT-3’。PCR擴增片段長度為367 bp。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共40個循環。以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參照，計算比值。

1.7 肝組織CYP2El蛋白表達檢測采用Western blot法，取肝組織200 mg，制備組織勻漿，加蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品。將蛋白樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉法將其轉移至硝酸纖維素膜上，以封閉液在室溫振蕩下封閉2 h，加入以封閉液稀釋的第一抗體（1:2500），4℃冰箱過夜，加吐溫-三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液洗滌，每次10 min，加l:2000稀釋的第二抗體于室溫下孵育2 h，加吐溫-三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液洗滌，每次10 min，加發光液進行化學發光顯影。

1.8 統計學分析采用SPSS l3.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，P＜O.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠創傷前后血清酶學的變化在制備TBI后6 h，各組大鼠血清ALT明顯升高，24 h達峰值水平；于TBI后12 h AST開始升高，24 h達峰值水平。各個TBI大鼠血清ALT、AST均顯著高于對照組（P＜0.05，表1）。

2.2 大鼠創傷前后肝組織MDA變化在TBI后6 h，大鼠肝組織MDA水平明顯升高，24 h達峰值，各個TBI組MDA水平與對照組均有顯著性差異（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平（±s）比較

表1 各組大鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

只數ALT（U/L）AST（U/L）MDA（nmol/mg）A組1042.2±8.144.0±7.25.2±0.2 B6組1083.0±10.3①53.3±10.214.2±0.2①B12組10244.5±63.4②280.4±53.3②17.5±0.3①B24組101204.5±146.6②790.3±114.5②56.3±0.5②

2.3 肝組織學表現A組動物肝組織在光鏡下肝小葉排列清晰，肝竇無擴張，肝細胞結構清楚，胞漿清晰，胞核完整，無腫脹、變性、壞死，無炎細胞浸潤（圖1）；B6組肝組織可見部分細胞水腫和炎性細胞浸潤（圖2）；B12組在損傷后12 h可見細胞空泡變性，胞漿疏松，偶可見點狀壞死，有較多的灶性炎細胞浸潤，細胞排列整齊，結構尚完整（圖3）；B24組可見肝小葉結構不清，肝竇明顯擴張，肝細胞大部分濁腫，胞漿疏松，可見脂滴，肝細胞散在點狀壞死，多處灶性壞死，細胞膜融合消失，細胞核破碎，大量炎細胞浸潤（圖4）。

圖1 正常大鼠肝組織學表現（HE，200×）

圖2 B6組大鼠肝組織學表現（HE，200×）

圖3 B12組大鼠肝組織學表現（HE，200×）

圖4 B24組大鼠肝組織學表現（HE，200×）

2.4 肝組織CYP2El表達情況A組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白表達水平最低，在模型組于傷后6 h開始升高，48 h達峰值，組間差異有顯著性意義（P＜0.01，表2和圖5、6）。

表2 各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白（CYP2E1/GAPDH，±s）表達情況

表2 各組肝組織CYP2E1 mRNA和蛋白（CYP2E1/GAPDH，±s）表達情況

與對照組比，①P＜0.05；②P＜0.01

只數CYP2E1 mRNACYP2E1蛋白A組30.28±0.0261.68±0.60 B6組30.89±0.05②120.24±1.22①B12組31.07±0.03②154.53±0.32②B24組31.50±0.02②200.40±2.61②

圖6 各組肝組織CYP2E1蛋白表達情況

3 討論

本組實驗顯示大鼠TBI后6 h即有血清肝酶升高和肝臟組織學改變,并隨病程延長肝損害由變性到壞死呈逐漸加重趨勢,符合TBI后HSI表現。關于HSI的發病機制尚不清楚,可能是氧化應激、細胞凋亡、缺血再灌注損傷等多因素共同作用的結果[8]。其中氧化應激可能是重要機制之一。有研究[3]顯示缺血再灌注損傷可引起大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。當ROS的產生過多超過機體抗氧化系統清除能力時，過多的ROS可攻擊鄰近組織、細胞，引起DNA、蛋白質和脂質的氧化或再氧化損害，破壞細胞和功能的完整性，產生氧化應激[5，13～15]。氧化應激反過來又可誘導多種紊亂和呼吸爆發，進一步加重組織的缺血缺氧和臟器的損傷[16]。肝實質細胞有3個部位可產生ROS，即線粒體、微粒體、過氧化物酶體，其中大量ROS使肝細胞膜脂質中的不飽和脂肪酸發生過氧化，形成脂質過氧化物[9，17，18]。MDA是重要的脂質過氧化物產物之一，其含量可反映組織過氧化程度。本實驗顯示肝組織MDA于TBI后6 h明顯升高，24 h達峰值，與肝酶及肝組織病理學改變一致。

細胞色素CYP450是位于滑面內質網上的一組混合功能氧化酶系，已確定的人類CYP450同功酶有20多種，其中CYP2E1是最主要的同功酶，其表達水平與代謝活性相關，受體內外諸多因素的影響，其代謝底物可誘導該酶本身的生成，它是微粒體脂質過氧化反應的催化劑[10]。本實驗顯示大鼠TBI后6 h開始，CYP2E1 mRNA及蛋白均較對照組表達明顯增強，并在24 h達峰值，證實CYP2E1表達增強的程度和HSI損傷程度與組織過氧化程度相關，故提示CYP2E1參與了HSI中氧化應激反應。

CYP2E1介導脂質過氧化主要表現在以下幾方面：（1）肝細胞內蓄積的游離脂肪酸可誘導CYP2E1活性增加[17]；（2）在正常情況下，細胞內存在自由基清除劑即氧化劑，如超氧化物歧化酶/谷胱甘肽等，可以隨時清除不斷生成的有害自由基，阻斷自由基的鏈式放大反應，從而保護細胞作用。隨著CYP2E1表達的增強，抗氧化劑SOD的含量顯著下降，提示脂質過氧化反應的增強和抗氧化劑能力下降，將導致自由基氧化細胞膜的脂質和蛋白質反應，最終導致肝細胞結構和功能的損害[18]；（3）CYP2E1的過表達可造成肝毒性和線粒體的損傷，同時有CYP2E1產生的活性氧通過擴散作用，激活肝星狀細胞，形成肝纖維化[19]；（4）CYP2E1過表達與脂質過氧化終產物顯著相關，還可誘導Kupffer細胞激活并增加炎癥因子釋放，CYP2E1抑制劑可阻止肝星狀細胞活化，這些都表明CYP2E1表達增強是氧化損傷、炎癥和肝纖維化進展的重要環節[20～22]。

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（收稿：2014-01-16）

（校對：陳從新）

Dynamic changes of cytochrome P4502El in liver tissues of rats with hepatic stress injury secondary to traumatic brain injury

Li Jing,Li Yi，Liu Tianhui，et al.Department of Gastroenterology，TiantanHospital，Affiliated to Capital Medical University，Beijing，100050，China

ObjectiveTo explore the dynamic changes of cytochrome P4502El（CYP2E1）in liver tissues of rats with hepatic stress injury（HSI）secondary to traumatic brain injury（TBI）.MethodsForty healthy male Wistar rats were randomly divided into sham-operated and TBI group.The animal model was established by an improved Feeney method.Serum levels of ALT and AST were measured by enzymatic assay at 6，12 and 24 h after TBI；MDA contents in liver tissues were also measured.Pathological changes of liver tissues were observed under light microscopy.The CYP2E1 mRNA levels and its protein expression were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.ResultsAt 6 h and 24 h after TBI，serum ALT elevated significantly[（83.0±10.3）U/ L and（1204.5±146.6）U/L，respectively，P＜0.01）]as compared with baseline[（42.2±8.1）U/L]；at 12 h after TBI，serum AST elevated significantly[（280.4±53.3）U/L，P＜0.01）]compared with baseline[（44.0±7.2））U/L]，and it peaked at 24 h[（790.3±114.5）U/L]；at 6 h after TBI，serum MDA elevated significantly[（14.2±0.2）nmol/mg，P＜0.05]compared with baseline[（5.2±0.2）nmol/mg]，and it peaked at 24 h after TBI[（56.3±0.5）nmol/mg]；at 24 h after TBI，the injuries in liver tissues were serious，with expanded sinus，scattered spotty necrosis and inflammatory cell infiltration；at 6 h after TBI，both mRNA and protein levels of CYP2E1 were significantly elevated[（0.89± 0.05）and（120.24±1.22），P＜0.05]compared with baseline[（0.28±0.02）and（61.68±0.60），respectively]，and they peaked at 24 h after TBI[（1.50±0.02）and（200.40±2.61），respectively，P＜0.01].ConclusionsCYP2E1 may be involved in oxidative stress in hepatic stress injury after TBI.

Hepatic stress injury；Cytochrome P4502El；Oxidative stress；Rats

100050北京市首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科（李靜，徐有青）；附屬北京友誼醫院肝病實驗中心（劉天會，尤紅）；遂寧市中心醫院感染病科（李毅）

李靜，女，30歲，碩士研究生，住院醫師。E-mail:185887400@qq.com

徐有青，E-mail:youqingxu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.017