長鏈脂肪酸通過GPR120 對脂肪細胞炎癥、內質網應激及胰島素信號分子的影響

代 喆，季振中，徐焱成?

（1.武漢大學中南醫院 內分泌科，湖北武漢 430071；2.武漢大學中南醫院 綜合科，湖北武漢 430071）

近年來，中國糖尿病發生率迅速增高，與肥胖的發生率升高密不可分[1]。 生活方式和飲食結構的改變是超重和肥胖的主要危險因素[2，3]。2010 年最新研究表明， 中國糖尿病患病率達到了9.7%，糖尿病前期患病率達到15.2%。 超重、肥胖、中心性肥胖和升高的甘油三酯水平都是糖尿病及糖尿病前期患病率增加的主要危險因素[4]。

肥胖狀態下， 過度增大的脂肪細胞因其儲存甘油三酯的能力已經飽和，由于“溢出效應”對于胰島素的抑制脂解作用不能有效應答， 發生了胰島素抵抗[5]，誘發了糖尿病的發生發展。 近年來，脂肪酸受體蛋白備受研究者的關注。 G 蛋白受體（G protein receptor，GPR120） 是最近發現的一種細胞膜脂肪酸受體蛋白[6]，是長鏈脂肪酸的特異性受體[7]。 GPR120 敲除的高脂飲食小鼠易肥胖，且并發肥胖引起的炎癥狀態、胰島素抵抗、糖耐量異常、 脂肪肝等一系列病理生理異常[8]。GPR120 是如何介導和調節長鏈脂肪酸對胰島素信號通路的影響目前還不清楚。 本研究擬從細胞學層面對其機制進行初步闡釋。

1 材料與方法

1.1 脂肪組織的選取

選取5 例擇期行膽結石膽囊手術的患者的大網膜脂肪組織約20g， 均簽署知情同意書， 男3例、女2 例；年齡47.3±6.2 歲。BMI 25.2±3.9kg/m2，空 腹 血 糖5.1±0.4mmol/L，TC 5.6±0.9mmol/L，TG 2.5 ±0.7mmol/L，LDL -C 4.3 ±1.1mmol/L，HDL -C 0.8±0.2mmol/L。 患者排除肝腎功能不全、腫瘤、感染性疾病及其他內分泌疾病。

1.2 主要試劑

GPR120 特異性抑制劑GW9508、PA 及二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）購自美國Sigma 公司；DMEM 培養基購自美國Gibco 公司； 胎牛血清購自杭州四季青公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司，RT-PCR 試劑盒，DNA Marker及Protein Marker 購自日本Takara 公司； 抗人GPR120、FABP4、TNFα、p-eIF2α、 胰島素信號通路蛋白IRS-1 及β-actin 抗體購自Santa 公司；Bradford 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，其他試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 成熟脂肪細胞的分離培養

參照已有的方法[9]，將新鮮的內臟脂肪組織剪碎后， 加入含膠原酶和BSA 的緩沖液中，37℃震蕩消化1h，輕輕攪拌將細胞打散。 將細胞懸液吸出后，400g 離心1min， 成熟的脂肪細胞會漂浮在上層，將上層成熟的脂肪細胞分離，并加入37℃白蛋白緩沖液400g 離心1min， 反復3 次后收獲成熟脂肪細胞并放入含BSA10%的DMEM 培養基中進行培養。

1.3.2 研究分組

長鏈多不飽和脂肪酸DHA 研究分為4 組：（1）空白對照組；（2）100μmol/L DHA 作用組；（3）100μmol/L DHA+10μmol/L GW9508 作用組；（4）100μmol/L DHA+20μmol/L GW9508 作用組。長鏈飽和脂肪酸PA 研究分為4 組：（1） 空白對照組；（2）100μmol/L PA 作 用 組；（3）100μmol/L PA+10μmol/L GW9508 作 用 組；（4）100μmol/L PA+20μmol/L GW9508 作用組。 每組試驗重復3 次。

1.3.3 實時定量PCR 檢測

細胞干預培養24h 后吸出上清液，用PBS 洗2 次，Trizol 提取細胞樣本的總RNA， 并逆轉錄成cDNA 置于-20℃保存。 實時定量PCR 在羅氏LC480 系統上進行，每個樣本設3 個平行對照。各基因的引物分別為：eIF2α：上游5'-TCAGGGTGGTAAAGTATGT-3'， 下游5'-GGATTGACTATGGTGGGT -3'；FABP4： 上 游 5' -AGAGGATGATAAACTGGTGGTG -3'，下游 5' -CGAACTTCAGTCCAGGTCAA-3'；GPR120： 上游5'-AGCCACCCTGTGCCCTACCT-3'， 下 游5'-GAGCCGTGATTGTGCCGTTG-3'；IRS-1：上游5'-GAAGAAGTGGCGGCACAAGTCG-3'， 下 游5'-CTGGTCAGGCAAAGGCGGTAGA-3'；β-actin：上游5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'， 下游5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。 mRNA的表達水平由Ct 值確定， 并與相應的β-actin 的Ct 值比較，得出mRNA 的相對表達水平。

1.3.4 Western blot 法檢測GPR120、FABP4、TNFα、p-eIF2α 及IRS-1 的蛋白表達水平

蛋白提取， 定量， 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，封閉，TBST 洗膜3 次，加入一抗4℃孵育過夜， 辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h，TBST 洗膜3 次，免疫印跡化學發光試劑盒曝光，顯影，定影，分析。蛋白的相對表達水平，與相應的β-actin 蛋白表達水平比較得出。

1.3.5 統計學方法

應用SPSS17.0 統計軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 長鏈多不飽和脂肪酸DHA 對脂肪酸受體及胰島素信號通路的影響

表1 示，在DHA 的刺激下，與空白對照組相比，GPR120（P<0.01）和FABP4（P<0.01）的mRNA水平增加，TNFα （P<0.01） 和p-eIF2α （P<0.05）mRNA 水平下降，IRS1（P<0.05）mRNA 水平升高。加 入10μmol/L GW9508 后， 與DHA 組 相 比，GPR120（P<0.05）、FABP（P<0.05）和IRS1（P<0.05）mRNA 水平下降，TNFα（P<0.01）和p-eIF2α（P<0.01）mRNA 水平升高。 加入20μmol/L GW9508后，與DHA 組相比，GPR120，FABP 和IRS1mRNA水 平 均 顯 著 下 降 （均P<0.01），TNFα 和peIF2αmRNA 水平顯著升高（均P<0.01）。

在DHA 刺激下（圖1A），GPR120、FABP4 的表達均增加 （均P<0.01），TNFα （P<0.01） 和peIF2α（P<0.05）表達下調，IRS1（P<0.05）表達上調。 加入GPR120 特異性抑制劑GW9508 后，GPR120（P<0.01）和FABP4（P<0.01）表達減少，伴隨著TNFα（P<0.01）和p-eIF2α（P<0.01）表達較不加GPR120 抑制劑時上調，IRS1（P<0.05）表達下調。

表1 DHA 和GW9508 作用下相關蛋白表達的相對定量

表2 PA 和GW9508 作用下相關蛋白mRNA 表達的相對定量

圖1 人脂肪細胞分別在DHA、PA 作用下及合并不同濃度GPR120 抑制劑（GW9508）作用下相關蛋白的表達

2.2 長鏈多飽和脂肪酸PA 對脂肪酸受體及胰島素信號通路的影響

表2 示， 在PA 的刺激下， 與空白對照組相比，GPR120（P<0.01）和FABP4（P<0.01）的mRNA水平增加，TNFα （P<0.05） 和p-eIF2α （P<0.01）mRNA 水平升高，IRS1（P<0.05）mRNA 水平下降。加 入10μmol/L GW9508 后， 與PA 組 相 比，GPR120（P<0.01）和FABP（P<0.01）水平下降，TNFα（P<0.05）和p-eIF2α（P<0.05）mRNA 水平升高。加 入20μmol/L GW9508 后， 與DHA 組相比，GPR120（P<0.01），FABP（P<0.01）和IRS1（P<0.05）mRNA 水平下降，TNFα（P<0.01）和p-eIF2α（P<0.05）mRNA 水平顯著升高。

在PA 的刺激下（圖1B），除TNFα（P＜0.05）和p-eIF2α（P＜0.01）表達上調、IRS1（P＜0.05）表達下調外，其余結果與DHA 刺激下相同。

3 討論

研究發現，脂肪酸不僅是一種營養物質，同樣也可以作為一種信號分子， 通過多種方式參與炎癥和內質網應激信號通路：（1）可以直接激活天然免疫系統受體Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），活化炎癥通路[10]；（2）可以被轉運到脂肪細胞內后，通過與脂肪酸結合蛋白（FABPs）的結合，在細胞內發揮作用[11]；（3）可以通過內質網應激通路發揮作用。另外，脂肪酸也在脂肪細胞中直接誘導內質網應激的發生[12]。 內質網應激可誘發炎癥機制，并與其形成惡性循環，加重脂肪細胞功能失調。 軟脂酸作為一種營養物中含量最豐富的飽和脂肪酸之一， 同時也是脂肪細胞脂解的產物和TLR4 受體的活化信號，激活炎癥通路，促進炎癥相關的胰島素抵抗的發生發展[6]。 雖然ω3 不飽和脂肪酸DHA 對TLR4 無明顯作用， 然而，DHA卻可以完全抑制棕櫚酸所誘導的TNFα 表達[6]。GPR120 受體在受到ω3 脂肪酸的刺激后，可以抑制LPS、TLR2、TLR3 和TNFα 在3T3-L1 和巨噬細胞中介導的炎癥反應[13]。這些發現提示，脂肪組織在處理脂肪酸的信號和代謝時， 存在著平衡機制，脂肪酸受體作為脂肪酸作用的“守門人”，可能起到了重要作用。

本研究結果顯示，DHA 作用于脂肪細胞時，如果GPR120 的表達受到抑制， 可降低胰島素下游通路IRS1 的表達， 減弱其胰島素增敏作用，TNFα 表達水平升高， 提示其抗炎癥作用受到抑制；p-eIF2α 表達水平升高，提示抗內質網應激作用受到抑制。 相應的，在PA 作用于脂肪細胞時，如果GPR120 的表達受到抑制， 可增加其誘導炎癥和內質網應激水平， 進一步加強致胰島素抵抗的作用。已有研究發現，在脂肪細胞中GPR120 的減少會降低IRS1 和GLUT4 的表達水平[14]。

脂肪酸結合蛋白4（FABP4）是一種重要的脂肪酸結合蛋白，可以介導炎癥、內質網應激、胰島素抵抗等多種機制[15]，并且，FABP4 與GPR120 具有一樣的表達部位， 均表達于巨噬細胞和脂肪細胞；也具有一樣的天然配體，中長鏈脂肪酸；并且在GPR120 表達下調時，FABP4 也表現出一致的變化[16，17]。 本研究結果顯示， 在GPR120 的配體DHA 和PA 脂肪酸的刺激下，GPR120 和FABP4表現出一致的表達升高趨勢， 而在GPR120 的表達受到抑制后，GPR120 和FABP4 表現出下降趨勢，進一步提示了兩者可能存在協同作用。

GPR120 在巨噬細胞功能異常中的調控作用也不容忽視。研究提示，脂肪細胞和巨噬細胞共存的狀態下，受到相同的刺激時，所分泌的炎癥因子水平明顯大于單一細胞[10]。這種對話機制的放大，可以進一步通過內分泌的方式對全身組織器官產生影響，促進了胰島素抵抗的發生發展。在脂肪組織中，GPR120 同時在脂肪細胞和巨噬細胞上都有表達。與瘦型人群相比，肥胖人群的脂肪組織中GPR120 的表達水平也更高[15]。 當巨噬細胞GPR120 的表達減少時，DHA 的抗炎癥反應也會減弱[14]。 GPR120 還介導了ω3 脂肪酸在巨噬細胞中對NLRP3 炎癥小體及其下游的caspase1 的抑制及對IL-1 分泌的抑制[18]。 除了在脂肪組織中，GPR120 還大量分布于小腸、味蕾和肺，新近的研究發現，GPR120 在人類和大鼠的胰腺中有表達，主要分布于巨噬細胞和間質細胞[19]。 目前相關的治療藥物也在進一步探索中[20]。

[1] Wang Y，Mi J，Shan XY，et al.Is China facing an obesity epidemic and the consequences? The trends in obesity and chronic disease in China[J].Int J Obes （Lond），2007，31（1）：177-188.

[2] Reynolds K，Gu D，Whelton PK，et al.InterASIA Collaborative Group.Prevalence and risk factors of overweight and obesity in China[J].Obesity （Silver Spring），2007，15（1）：10-18.

[3] Barry M.Popkin.Will China’s nutrition transition overwhelm its health care system and slow economic growth?[J].Health Affairs，2008，27（4）：1064-1076.

[4] Yang W，Lu J，Weng J，et al.China National Diabetes and Metabolic Disorders Study Group.Prevalence of diabetes among men and women in China [J].N Engl J Med，2010，362（12）：1090-1101.

[5] Frayn KN.Obesity and metabolic disease：is adipose tissue the culprit?[J].Proc Nutr Soc，2005，64 （1）：7-13.

[6] Hirasawa A，Tsumaya K，Awaji T，et al.Free fatty acids regulate gut incretin glucagon-like peptide-1 secretion through GPR120[J].Nat Med，2005，11（1）：90-94.

[7] Cartoni C，Yasumatsu K，Ohkuri T，et al.Taste preference for fatty acids is mediated by GPR40 and GPR120 [J].J Neurosci，2010，30（25）：8376-8382.

[8] Ichimura A，Hirasawa A，Poulai n-Godefroy O，et al.Dysfunction of lipid sensor GPR120 leads to obesity in both mouse and human[J].Nature，2012，483（7389）：350-354.

[9] Carswell KA，Lee MJ，Fried SK.Culture of isolated human adipocytes and isolated adipose tissue [J].Methods Mol Biol，2012，806：203-214.

[10] Shi H，Kokoeva MV，Inouye K，et al.TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance [J].J Clin Invest，2006，116（11）：3015-3025.

[11] Furuhashi M，Hotamisligil GS.Fatty acid-binding proteins：role in metabolic diseases and potential as drug targets[J].Nat Rev Drug Discov，2008，7（6）：489-503.

[12] Jiao P，Ma J，Feng B，et al.FFA-induced adipocyte inflammation and insulin resistance： involvement of ERstress and IKKbeta pathways [J].Obesity （Silver Spring），2011，19（3）：483-491.

[13] Oh DY，Talukdar S，Bae EJ，et al.GPR120 is an omega-3 fatty acid receptor mediating potent anti-inflammatory and insulin-sensitizing effects[J].Cell，2010，142（5）：687-698.

[14] Li X，Yu Y，Funk CD.Cyclooxygenase -2 induction in macrophages is modulated by docosahexaenoic acid via interactions with free fatty acid receptor 4 （FFA4）[J].FASEB J，2013，27（12）：4987-4997.

[15] Furuhashi M，Fucho R，Gorgün CZ，et al.Adipocyte/macrophage fatty acid -binding proteins contribute to metabolic deterioration through actions in both macrophages and adipocytes in mice[J].J Clin Invest，2008，118（7）：2640-2650.

[16] Gotoh C，Hong YH，Iga T，et al.The regulation of adipogenesis through GPR120 [J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354（2）：591-597.

[17] Ichimura A，Hirasawa A，Hara T，et al.Free fatty acid receptors act as nutrient sensors to regulate energy homeostasis [J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2009，89 （3-4）：82-88.

[18] Yan Y，Jiang W，Spinetti T，et al.Omega-3 fatty acids prevent inflammation and metabolic disorder through inhibition of NLRP3 inflammasome activation [J].Immunity，2013，38（6）：1154-1163.

[19] Zhao Y，Zha D，Wang L，et al.Phenotypic characterization of GPR120-expressing cells in the interstitial tissue of pancreas[J].Tissue Cell，2013，45（6）：421-427.

[20] Hudson BD，Shimpukade B，Mackenzie AE，et al.The pharmacology of TUG-891，a potent and selective agonist of the free fatty acid receptor 4（FFA4/GPR120），demonstrates both potential opportunity and possible challenges to therapeutic agonism[J].Mol Pharmacol，2013，84（5）：710-725.