p38MAPK信號通路在清熱解毒通腑液保護大鼠膿毒癥心肌損傷中的作用

陳上仲等

[摘 要] 目的 探討清熱解毒通腑中藥液對膿毒癥大鼠心肌損傷的作用及其可能機制。方法 采用盲腸結扎穿孔法（CLP）制備膿毒癥動物模型。180只雄性wistar大鼠，隨機分為對照組（control）60只、膿毒癥組（sepsis）60只、治療組（treatment）60只。治療組從造模前96小時（96h）開始按10ml/（kg-1·d-1）灌胃給予清熱解毒通腑中藥液，膿毒癥組及對照組按相同方法予等量09%氯化鈉注射液。分別于造模后3h，6h，12h，24h，48h，72h六個時間點檢測各亞組大鼠心功能、血清炎癥因子（TNF_a、IL_6、IL_10）、心肌p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen_activated protein kinase，p38MAPK）等指標。結果 與對照組比較，膿毒癥組在造模后3h心肌p38MAPK磷酸化水平出現升高并達高峰（P<001）；血清炎癥因子在3h出現升高（P<005），其中TNF_a在造模后3h達高峰（P<001），IL_6于造模后12h達高峰（P<001）；心功能指標從3h即出現下降（P<005），至12h下降最明顯（P<001）。與膿毒癥組比較，治療組各項指標均有所改善（P<005）。結論 清熱解毒通腑中藥液對膿毒癥大鼠心肌損傷具有保護作用，其作用機制可能是通過p38MAPK信號途徑，調控機體免疫炎癥反應，從而對膿毒癥大鼠心肌損傷起到保護作用。

[關鍵詞] 膿毒癥；p38MAPK；清熱解毒通腑中藥液；心肌損傷；炎癥因子

中圖分類號：R5542；R243 文獻標識碼：A 文章編號：1009_816X（2014）02_0102_04

doi：103969/jissn1009_816x20140205Effects of p38MAPK on Heat_clearing and Detoxicating Drug in Septic Rats with Myocardial Injury CHEN Shang_zhong， LI li， HU Cai_bao， et al The Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang 310013， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of p38MAPK on heat_clearing and detoxicating drug in septic rats with myocardial injury and the possible mechanism Methods Male adult rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture （CLP） Total 180 male adult wistar rats were randomly divided into control group（n=60）， sepsis group（n=60） and treatment group（n=60） The rats in treatment group were pretreated with decoction by10ml/（kg-1·d-1） 96h before CLP， and rats in other two groups were pretreated with normal saline in the same way Cardiac function was assessed at 3h，6h，12h，24h，48h and 72h after CLP or sham surgery， and the detections of the level of phosphorylation of p38MAPK、 the level of inflammatory cytokines （TNF_a， IL_6， IL_10） were tested respectively Results Compared with control group， the expression of p38MAPK protein are increased significantly and peaked 3h after the surgery（P<001）， cardiac function in sepsis group decreased significantly since 3h after the surgery， while a remarkable decrease could be observed at post_challenge of 12h（P<001）； serum inflammatory factors including TNF_a， IL_6 in sepsis group increased significantly since 3h after the surgery TNF_a reached peaked at 3h（P<001），the IL_6 reached peaked at 12h（P<001）. Compared with sepsis group， cardiac function，the level of inflammatory cytokines and the level of phosphorylation of p38MAPK were all improved in treatment group Conclusions Heat_clearing and detoxicating drug may decrease myocardial injury in septic rats Further， p38MAPK signaling pathway may play an important role through regulating the inflammation reaction during sepsis.

[Key words] Sepsis； P38MAPK； Heat_clearing and detoxicating drug； Myocardial injury； Inflammatory factors

膿毒癥是危重病患者常見的死亡原因之一。而膿毒癥合并心功能不全的病死率可由20%～30%[1]增加至70%～90%[2]。因此，在治療膿毒癥的基礎上，有效防治膿毒癥繼發的心功能障礙是降低膿毒癥患者病死率的關鍵所在。近期研究報道一系列信號轉導通路參與膿毒癥心功能障礙的發生發展，其中p38MAPK信號轉導通路是炎癥反應的重要通路，與膿毒癥心功能障礙密切相關[3，4]。朱祖成等[5]報道清熱解毒通腑中藥可通過抑制炎癥因子的表達對冠心病心肌缺血起保護作用，但其對膿毒癥炎癥反應所致心肌損傷的保護作用尚不清楚。為此，本研究探討清熱解毒通腑中藥對膿毒癥心肌損傷的保護作用，及其可能機制是否與p38MAPK信號通路有關。

1 資料與方法

11 材料：SPF（specific pathogen free 無特定病原體）級雄性wistar大鼠180只，體重為250～300g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。清熱解毒通腑中藥液，主要成分：大黃、枳實、厚樸、丹皮等6味中藥煎制而成（100ml藥液含生藥96g），由浙江醫院制劑中心提供。3%戊巴比妥鈉、20%烏拉坦由浙江中醫藥大學實驗中心配置。腫瘤壞死因子_a（TNF_a）、白介素_6（IL_6）、白介素_10（IL_10）等單克隆抗體（美國Ebioscience公司）；p38MAPK、p_p38MAPK抗體（美國CST公司）。生理記錄儀（RM_6000，日本光電公司）；心功能分析儀（MPA_CFS，上海奧爾科特生物科技有限公司）。酶標儀（美國Thermo公司）；電泳儀、轉膜儀（美國BIO_RAD公司）。

12 方法：

121 分組與給藥：取雄性wistar大鼠180只（體重：250～300g），根據隨機數字表法隨機分為：對照組（60只），膿毒癥組（60只），治療組（60只），再按照造模后3h、6h、12h、24h、48h及72h六個不同時點分成6個亞組（n=10）。術前96h開始，治療組灌胃給予清熱解毒通腑中藥液10ml/（kg-1·d-1），對照組及膿毒癥組按相同方法予等量09%氯化鈉注射液。

122 膿毒癥模型制備：采用盲腸結扎穿孔法（CLP）制備腹腔感染膿毒癥動物模型。三組大鼠禁食12h后，，按15ml/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，腹部消毒鋪巾，于中下腹部正中做2cm縱行切口，充分暴露盲腸，僅膿毒癥組和治療組于距盲腸末端1/3處采用3號縫合線環形結扎，保證腸道通暢，并距結扎處05cm采用18號針頭貫穿盲腸3次，并輕輕擠壓確保糞便溢出，后逐層關腹。術后自由進食進水。對照組僅行開腹手術，盲腸不結扎、穿孔，余同膿毒癥組。

123 心功能檢測：各亞組分別于造模后3h、6h、12h、24h、48h、72h各時間點，用20%烏拉坦按5ml/kg腹腔注射麻醉，頸部消毒鋪巾，沿頸部正中線切開皮膚，分離右側頸總動脈，將連接RM_6000八道生理記錄儀的PE_50聚乙烯管插入右側勁總動脈直至左心室，術畢穩定10～15min，記錄并采樣分析：左室舒張末壓（lvedp）、左室發展壓（lvdp），左室內壓上升/下降最大速率（±dP/dt）等各項心功能指標。

124 血清炎癥因子檢測：各亞組心功能檢測完畢后，通過插入頸總動脈的PE_50聚乙烯導管取血5ml，用臺式離心機3000r/min離心15min后，取上清液于-70℃冰箱保存，嚴格按檢測試劑盒說明書操作，測定血清TNF_a、IL_6、IL_10等指標。

125 心肌細胞p38MAPK表達水平檢測：取心肌組織用10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，免疫組化切片觀察心肌組織p38MAPK及p_p38MAPK表達情況。另取心肌組織勻漿后，取上清適量，采用蛋白免疫印跡法（Western_blot），抽提細胞蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，電泳后轉移到PVDF膜上，加入一抗、二抗后化學發光法顯影，美國BIO_RAD公司Quantity One分析軟件對顯影條帶進行灰度分析，將p38MAPK、p_p38MAPK與GAPDH灰度值的比值作為p38MAPK、p_p38MAPK的相對活化水平。

13 統計學處理：應用SPSS160軟件進行統計學分析。各組計量資料以（x -±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<005為差異有統計學意義。

2 結果

21 三組大鼠一般狀況及生存率比較：對照組大鼠造模后出現進食減少、疲乏，活動范圍縮小，無寒戰、豎毛，無嗜睡、腹瀉等表現，6h～12h內恢復至造模前狀態。膿毒癥組大鼠造模后出現明顯的進食減少、活動范圍縮小、寒戰、豎毛、嗜睡、腹瀉等膿毒癥表現，72h后逐漸恢復至造模前狀態。治療組造模后出現進食減少，活動范圍縮小、寒戰、豎毛、嗜睡、腹瀉等，但癥狀較膿毒癥組有所減輕，48h后逐漸恢復至造模前狀態。膿毒癥組大鼠造模后各時間點生存率均較對照組下降（P<005），差異有統計學意義。與膿毒癥組比較，治療組各時間點生存率均有所提高（P<005），差異有統計學意義。對照組總體生存率100%；膿毒癥組總體生存率：7333%；治療組總體生存率：8333%。其中膿毒癥組分別于3h點死亡2只，6h點死亡3只，12h點死亡4只，24h點死亡4只，48h點死亡2只，72h點死亡1只；治療組分別于3h點死亡1只，6h點死亡2只，12h點死亡3只，24h點死亡3只，48h點死亡1只，72h點死亡0只。

22 三組大鼠各時間點心功能指標比較：與對照組比較，膿毒癥組于造模后3h即開始出現+dp/dt、-dp/dt及lvdp降低（P<005），至造模后12h下降最明顯：+dp/dt（872025±107177）mmHg vs（304717±39624）mmHg（P<001）；-dp/dt（-600093±87748）mmHg vs（-196077±48395）mmHg（P<001）；lvdp（11076±1598）mmHg vs（5157±1368）mmHg（P<001），于造模后48h～72h逐漸恢復至正常水平。于造模后6h開始出現lvedp升高（P<005），至造模后24h升高最明顯：（2025±592）mmHg vs（4016±243）mmHg（P<001），于造模后48h逐漸恢復至正常水平。而中藥組可有效地改善膿毒癥降低的心功能（P<005）。

23 三組大鼠各時間點血清炎癥因子指標比較：如圖1所示。與對照組比較，膿毒癥組早期即出現炎癥因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在膿毒癥組3h即達高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在膿毒癥12h達到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h開始升高，至48h達高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h開始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治療組較膿毒癥組血清各項指標均有所改善（P<005）。

圖1 三組大鼠各時間點炎癥因子指標比較

A：三組大鼠各時間點腫瘤壞死因子_a（TNF_a）比較；B：三組大鼠各時間點白介素_6（IL_6）比較；C：三組大鼠各時間點白介素_10（IL_10）比較

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

24 三組大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比較：如圖2。各組大鼠各時間點p38MAPK總蛋白水平差異無統計學意義（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在膿毒癥組早期出現升高，3h即達高峰（P<001），后逐漸下降，治療組較膿毒癥組有所改善（P<005）。三組大鼠心肌細胞內p38MAPK表達水平無明顯差異；而p_p38MAPK在膿毒癥組表達水平較對照組明顯增加，治療組較膿毒癥組有所減低。

圖2 三組大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表達水平

A：三組大鼠各時間點p38MAPK與GAPDH灰度值之比；B：三組大鼠各時間點p_p38MAPK與GAPDH灰度值之比

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

3 討論

膿毒癥在中醫理論中屬“溫病”范疇，其中醫辨證主要有實熱證、血瘀證、腑氣不通、厥脫等四大證型。“三證三法”在膿毒癥治療中具有一定的療效[6]，即：毒熱證和清熱解毒法；瘀血證和活血化瘀法；急性虛證和扶正固本法。清熱解毒通腑中藥液具有通腑瀉熱、活血化瘀、益氣養陰的功效，能針對膿毒癥病機及證型進行治療。本研究發現清熱解毒通腑中藥液能有效改善膿毒癥大鼠心功能，對膿毒癥心肌損傷具有保護作用，但其作用機制目前尚不清楚，可能與炎癥因子及其上下游信號通路有關。

近年來Anas等[7]研究表明，膿毒癥心肌損傷與炎癥因子導致的機體炎癥反應過激和免疫抑制狀態密切相關。炎癥反應過激和免疫抑制均可直接或間接的損傷心肌細胞，影響心肌線粒體、內質網代謝、心肌細胞鈣循環以及誘導的心肌細胞凋亡等，最終導致心功能障礙的發生。在我們的研究中，膿毒癥組早期TNF_a、IL_6升高并達高峰，而IL_10于晚期達高峰，呈現出早期炎癥反應過激與晚期免疫抑制雙向異常狀態，與此同時心功能指標在膿毒癥早期3h即出現下降，在12h下降最明顯，而清熱解毒通腑中藥治療組，炎癥反應過激及免疫抑制程度均較膿毒癥組有所減輕，心功能障礙較膿毒癥組有所改善。這提示清熱解毒通腑中藥可能通過調節炎癥因子水平，對膿毒癥大鼠心肌損傷起到保護作用，但其具體

23 三組大鼠各時間點血清炎癥因子指標比較：如圖1所示。與對照組比較，膿毒癥組早期即出現炎癥因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在膿毒癥組3h即達高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在膿毒癥12h達到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h開始升高，至48h達高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h開始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治療組較膿毒癥組血清各項指標均有所改善（P<005）。

圖1 三組大鼠各時間點炎癥因子指標比較

A：三組大鼠各時間點腫瘤壞死因子_a（TNF_a）比較；B：三組大鼠各時間點白介素_6（IL_6）比較；C：三組大鼠各時間點白介素_10（IL_10）比較

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

24 三組大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比較：如圖2。各組大鼠各時間點p38MAPK總蛋白水平差異無統計學意義（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在膿毒癥組早期出現升高，3h即達高峰（P<001），后逐漸下降，治療組較膿毒癥組有所改善（P<005）。三組大鼠心肌細胞內p38MAPK表達水平無明顯差異；而p_p38MAPK在膿毒癥組表達水平較對照組明顯增加，治療組較膿毒癥組有所減低。

圖2 三組大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表達水平

A：三組大鼠各時間點p38MAPK與GAPDH灰度值之比；B：三組大鼠各時間點p_p38MAPK與GAPDH灰度值之比

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

3 討論

膿毒癥在中醫理論中屬“溫病”范疇，其中醫辨證主要有實熱證、血瘀證、腑氣不通、厥脫等四大證型。“三證三法”在膿毒癥治療中具有一定的療效[6]，即：毒熱證和清熱解毒法；瘀血證和活血化瘀法；急性虛證和扶正固本法。清熱解毒通腑中藥液具有通腑瀉熱、活血化瘀、益氣養陰的功效，能針對膿毒癥病機及證型進行治療。本研究發現清熱解毒通腑中藥液能有效改善膿毒癥大鼠心功能，對膿毒癥心肌損傷具有保護作用，但其作用機制目前尚不清楚，可能與炎癥因子及其上下游信號通路有關。

近年來Anas等[7]研究表明，膿毒癥心肌損傷與炎癥因子導致的機體炎癥反應過激和免疫抑制狀態密切相關。炎癥反應過激和免疫抑制均可直接或間接的損傷心肌細胞，影響心肌線粒體、內質網代謝、心肌細胞鈣循環以及誘導的心肌細胞凋亡等，最終導致心功能障礙的發生。在我們的研究中，膿毒癥組早期TNF_a、IL_6升高并達高峰，而IL_10于晚期達高峰，呈現出早期炎癥反應過激與晚期免疫抑制雙向異常狀態，與此同時心功能指標在膿毒癥早期3h即出現下降，在12h下降最明顯，而清熱解毒通腑中藥治療組，炎癥反應過激及免疫抑制程度均較膿毒癥組有所減輕，心功能障礙較膿毒癥組有所改善。這提示清熱解毒通腑中藥可能通過調節炎癥因子水平，對膿毒癥大鼠心肌損傷起到保護作用，但其具體

23 三組大鼠各時間點血清炎癥因子指標比較：如圖1所示。與對照組比較，膿毒癥組早期即出現炎癥因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在膿毒癥組3h即達高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在膿毒癥12h達到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h開始升高，至48h達高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h開始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治療組較膿毒癥組血清各項指標均有所改善（P<005）。

圖1 三組大鼠各時間點炎癥因子指標比較

A：三組大鼠各時間點腫瘤壞死因子_a（TNF_a）比較；B：三組大鼠各時間點白介素_6（IL_6）比較；C：三組大鼠各時間點白介素_10（IL_10）比較

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

24 三組大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比較：如圖2。各組大鼠各時間點p38MAPK總蛋白水平差異無統計學意義（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在膿毒癥組早期出現升高，3h即達高峰（P<001），后逐漸下降，治療組較膿毒癥組有所改善（P<005）。三組大鼠心肌細胞內p38MAPK表達水平無明顯差異；而p_p38MAPK在膿毒癥組表達水平較對照組明顯增加，治療組較膿毒癥組有所減低。

圖2 三組大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表達水平

A：三組大鼠各時間點p38MAPK與GAPDH灰度值之比；B：三組大鼠各時間點p_p38MAPK與GAPDH灰度值之比

注：與對照組比較*P<005，**P<001；與膿毒癥組比較#P<005，##P<001

3 討論

膿毒癥在中醫理論中屬“溫病”范疇，其中醫辨證主要有實熱證、血瘀證、腑氣不通、厥脫等四大證型。“三證三法”在膿毒癥治療中具有一定的療效[6]，即：毒熱證和清熱解毒法；瘀血證和活血化瘀法；急性虛證和扶正固本法。清熱解毒通腑中藥液具有通腑瀉熱、活血化瘀、益氣養陰的功效，能針對膿毒癥病機及證型進行治療。本研究發現清熱解毒通腑中藥液能有效改善膿毒癥大鼠心功能，對膿毒癥心肌損傷具有保護作用，但其作用機制目前尚不清楚，可能與炎癥因子及其上下游信號通路有關。

近年來Anas等[7]研究表明，膿毒癥心肌損傷與炎癥因子導致的機體炎癥反應過激和免疫抑制狀態密切相關。炎癥反應過激和免疫抑制均可直接或間接的損傷心肌細胞，影響心肌線粒體、內質網代謝、心肌細胞鈣循環以及誘導的心肌細胞凋亡等，最終導致心功能障礙的發生。在我們的研究中，膿毒癥組早期TNF_a、IL_6升高并達高峰，而IL_10于晚期達高峰，呈現出早期炎癥反應過激與晚期免疫抑制雙向異常狀態，與此同時心功能指標在膿毒癥早期3h即出現下降，在12h下降最明顯，而清熱解毒通腑中藥治療組，炎癥反應過激及免疫抑制程度均較膿毒癥組有所減輕，心功能障礙較膿毒癥組有所改善。這提示清熱解毒通腑中藥可能通過調節炎癥因子水平，對膿毒癥大鼠心肌損傷起到保護作用，但其具體