CpG ODN對胰腺癌細胞PANC1吉西他濱化療敏感性的影響

吳漢青 王博 薛寅凱 鄭海 陳立波 吳河水

吉西他濱是臨床上抗胰腺癌的一線化療藥物。吉西他濱與生物靶向藥物聯用以提高療效和降低毒性反應是近年來研究的熱點。Toll樣受體9(Toll-like receptor，TLR9)于2000年被首次成功克隆，配體為非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列的DNA(CpG DNA)[1]。目前發現TLR9不僅表達于免疫細胞，還表達于多種腫瘤細胞，并且TLR9信號的活化與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移以及耐藥性等密切相關[2]。本研究應用TLR9激動劑CpG ODN2216干預胰腺癌PANCl細胞株，觀察其對胰腺癌細胞增殖及對吉西他濱敏感性的影響，探討提高胰腺癌化療效果的可能途徑。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞PANC1由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院普外實驗室提供，常規培養、傳代。CpG ODN2216序列為5′-GGGGGACGATCG-TCGGGGGG-3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，全硫代磷酸化修飾，PAGE純化。兔抗人TLR9單抗購自美國cell signaling公司。免疫熒光試劑盒購自武漢博士德公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購自美國sigma公司。注射用鹽酸吉西他濱購自法國Lilly公司。

二、免疫熒光化學法

用胰酶消化PANC1細胞，制成單細胞懸液，滴到玻片上，常規培養24～36 h。取出爬片，PBS漂洗3次，每次5 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS再漂洗3次；用0.5%Triton穿孔20 min，再用PBS漂洗3次后用5%BSA封閉30 min。甩干液體后，加入稀釋的TLR9單抗，用PBS代替一抗作為對照。4℃孵育過夜后PBS漂洗3次，加入稀釋的二抗置37℃孵育1 h，PBS漂洗3次后加入稀釋的SABC-FITC，置37℃繼續孵育30 min。用PBS漂洗3次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

三、蛋白質印跡法

收集對數生長期的細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次。加入5倍體積的組織蛋白裂解液，置冰上30 min，12 000 r/min離心2 min。上清經蛋白定量后取50 μg常規行蛋白質印跡法檢測TLR9蛋白，以β-actin為內參，最后ECL化學發光，暗室中曝光和顯影。采用自動電泳凝膠成像分析軟件(Band scan v5.0)進行圖像掃描，以TLR9蛋白與內參灰度值比表示蛋白的相對表達量。

四、四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法

取對數生長期PANC1細胞，調整細胞密度為1×105/ml，取100 μl接種于96孔細胞培養板，每孔1×104個細胞。實驗分為4組：(1)CpG ODN2216組：細胞培養液中加入終濃度為10 μg/ml的CpG ODN2216[3]；(2)吉西他濱組：細胞培養液中分別加入含0、0.01、0.1、1、10 mg/L的吉西他濱；(3)CpG ODN2216+吉西他濱組：細胞培養液中加入終濃度為10 μg/ml的CpG ODN2216以及分別含0、0.01、0.1、1、10 mg/L的吉西他濱；(4)對照組：培養液為單純的DMEM高糖培養液。每組細胞每個濃度吉西他濱均設6個復孔。37℃培養72 h，分別加入MTT 20 μl，繼續培養4 h，棄去培養液，加入DMSO 100 μl，室溫振蕩10 min。酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度(A490)值，取各復孔平均值為各組結果。實驗結果以細胞生長抑制率表示，細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A490值/對照組A490值)×100%。重復實驗3次，取均值。

五、統計學處理

結 果

一、PANC1細胞的TLR9蛋白表達

免疫熒光染色結果顯示，TLR9在PANC1細胞中呈現高表達，主要表達在胞質，呈現綠色熒光(圖1a)，以PBS替代TLR9一抗的對照組未見綠色熒光(圖1b)。蛋白質印跡法結果顯示，PANC1細胞TLR9蛋白相對表達量為0.834±0.056，不加抗體的對照組未檢出TLR9蛋白(圖2)。

圖1 PANC1細胞的TLR9表達(免疫熒光染色 ×200)

圖2 PANC1細胞TLR9蛋白表達(蛋白質印跡法)

二、PANC1細胞對吉西他濱敏感性的變化

0.01、0.1、1、10 mg/L吉西他濱干預經CpG ODN2216處理的PANC1細胞的生長抑制率分別為(34.1±1.3)%、(43.5±2.7)%、(76.3±2.5)%、(95.3±2.2)%，干預未經CpG ODN2216處理的PANC1細胞的生長抑制率分別為(14.5±0.9)%、(23.5±1.1)%、(44.8±1.4)%、(63.6±1.8)%，兩組差異均有統計學意義(t值分別為21.7、12.2、19.4、18.6，P值均<0.01)。CpG ODN2216+吉西他濱組PANC1細胞對吉西他濱的半數抑制劑量(IC50)為(0.28±0.13)mg/L，吉西他濱組PANC1的IC50為(1.23±0.14)mg/L，兩組差異有統計學意義(t=19.6，P<0.01)。單獨應用CpG ODN2216亦抑制PANC1細胞的生長，抑制率達(17.4±0.8)%，與對照組比較，差異有統計學意義(t=22.4，P<0.01)。

討 論

胰腺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其惡性程度高，發病隱匿，對現有治療手段療效不佳，預后極差[4]。吉西他濱可以顯著延長胰腺癌患者生存期和提高臨床受益率，它與生物靶向藥物聯用以提高療效和降低毒性反應是近年來的研究熱點。

近來發現Toll樣受體可能參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程。而TLR9為該家族重要成員[5]。諸多的研究結果表明，TLR9誘導的信號通路可能在腫瘤形成過程中起著重要作用。研究還發現，TLR9在腫瘤細胞的表達可作為腫瘤化療、免疫治療的新靶點[6-7]。CpG ODN為人工合成的TLR9特異性配體，以非甲基化的CpG基序為核心的DNA序列，在細菌感染過程中，機體細胞Toll樣受體9能識別細菌CpG DNA，觸發機體產生針對細菌的保護性免疫應答，提高宿主細胞清除細菌的能力。CpG DNA通過胞吞作用進入宿主細胞，在溶酶體中與TLR9相互作用，并通過髓性分化因子88(MyD88)依賴的信號通路激活免疫應答[8-9]。因此CpG ODN逐漸成為腫瘤免疫治療的候選制劑并得到青睞。

化療在胰腺癌的綜合治療中占有重要地位，其中吉西他濱可顯著提高胰腺癌患者腫瘤切除術后的生存期[10-11]。它主要通過摻入DNA鏈誘導細胞凋亡，可與其他能夠誘導癌細胞凋亡的抗腫瘤治療產生協同作用。研究顯示，通過協同活化TLR9受體，可增加癌細胞的凋亡，從而增強對吉西他濱的敏感性。本研究結果顯示， PANC1細胞高表達TLR9蛋白。應用TLR9激動劑CpG ODN2216處理PANC1細胞，可顯著提高細胞對吉西他濱的化療敏感性，細胞的生存率呈濃度依賴性下降。本研究結果為今后進一步研究人胰腺癌細胞株的體內化療敏感機制提供了實驗基礎。

參 考 文 獻

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